专利名称：：利用reg4蛋白诊断胰腺癌症的方法
技术领域：
：本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及癌症i貪断领域。特别是，本发明涉及利用reg4蛋白作为血清学标志诊断胰腺癌症的方法，以及用于所述诊断的试剂和试剂盒。
背景技术：
：在西方世界，胰腺导管腺癌(pdac)排在癌症死亡原因的第五位，其在恶性肿瘤中死亡率最高，5年存活率只有4%(dimagnoep，"a/.,(l"9)gastroenterology.;117(6):1464-84.，zervosee,"a/.,(2004)cancercontrol.;ll(l):23-31.)。在美国，大约30,700名患者被诊断为胰腺癌症，其中几乎30,000名会死于该病(jemala,"a/.，(2003)cacancerjclin.;53(l):5-26)。由于大多数pdac患者在诊断时是晚期，目前尚无有效治疗方法；只有手术切除能提供少许治愈的可能性，但是80%-90%接受手术的pdac患者会复发及死于该病(dimagnoep,^"/.,(1999)gastroenterology.;117(6):1464-84.，zervosee,&a/.，(2004)cancercon加l.;ll(l):23-31)。一些外科方法和化学疗法(包括5-fu或吉西他滨)，结合或不结合放射，能提高患者的生活质量(dimagnoep,a/.，(1999)gastroenterology.;117(6):1464-84.，zervosee,&(2004)cancercontrol.;11(1):23-31),但是那些疗法对pdac患者长期生存的作用非常有限，因为胰腺癌症极具侵袭性和化疗耐药性。因此，大多数晚期pdac患者的治疗集中在姑息疗法(palliativemeasures)(dimagnoep,a/.,(1999)gastroenterology.;117(6):1464-84.，zervosee,"a/.,(2004)cancercontrol.;11(1):23-31)。pdac这种可怕的预后源于几个原因，包括早期pdac难以检测(zervosee,^a/.,(2004)cancercontrol.;11(1):23-31)。尽管在诊断影像学方面有一些进步，比如内镜超声检查(eus)或磁共振胰胆管造影术(mrcp),但是大多数患者直到疾病晚期才出现症状，因此，直到显现症状才会接受影像学检查。准确且容易的血清学试验，例如前列腺癌症中的前列腺特异性抗原(psa)，可以促进没有表现症状的早期pdac的检测，通过所迷试验进行的筛查可以应用于大量群体以纟企测早期pdac。早期胰腺癌症手术切除可以提供相对有利的预后，5年存活率可达50%-60%,而晚期胰腺癌的存活率4又百分之几(zervosee,efa/.,(2004)cancercontrol.;11(1):23-31)。考虑到pdac的生物学侵袭性和对化学疗法的抵抗，改善致命的pdac的预后的最现实的策略之一是采用非侵入性血清学试验来筛查高危人群，才企测手术切除可能治愈的早期pdac。目前，ca19-9是唯一可商购的用于pdac的血清学标志物，然而，大约10%-15%的个体由于其lewis抗原体质而不分泌ca19-9，而且当胰腺癌症处于早期且无症状的阶段时ca19-9水平通常在正常范围内，因此ca19-9的区分值專交差(sawabun,"a/.，(2004)pancreas.;28(3):263-7.,pleskowdk,"a/.,(1989)anninternmed.;110(9):704-9)。因此，迫切需要鉴定新型pdac肿瘤标志物，利用所述血清学标志物如前列腺癌中的psa，制定筛查策略以;险测早期胰腺癌。
发明内容本发明基于朋g^基因在胰腺癌症中特异性过表达这一发现。本发明人在进行全基因组cdna《效阵列分析(nakamurat,da/.,(2004)oncogene.;23(13):2385-400,wo2004/031412)时，鉴定出数十种在pdac细胞中上调的基因，对于本研究，本发明人集中于其中的朋g4(genbank登录号ay126670;seqidno:13的核苷酸序列，编码seqidno:14的氨基酸序列)。本发明人关于20个显微解剖的pdac细胞群体的微阵列数据显示了i^g4在经;险查、可提供信息的10个病例中高水平上调(nakamurat,etal.,(2004)oncogene;23(13):2385-400)，这次在经4全查的12个显樣吏解剖的pdac细胞群体(已经用于以前的微阵列分析)的6个中，用rt-pcr确认了reg4过表达(图1a)。尽管在以前的研究中，朋g4也被称为朋g/f(genbank登录号aa316525),但是reg4和regiv是相同的分子。虽然本发明人已经鉴定了i^g4基因在胰腺癌症组织中是上调的，但是，预期患有早期癌症或具有良好预后的pdac患者血中reg4水平有所提高这一发现对本发明来说是新颖的。而且，胰腺癌症患者血中reg4的水平提高显示，该基因和其蛋白作为新型诊断标志物(即全血、血清或血浆)可能是有用的。此外，本发明人建立了夹心elisa,以检测患有可切除pdac的患者中的血清reg4。因此，本发明提供诊断受试者中的胰腺癌症的方法，所述方法包括如下步骤测定源自受试者的血液样品中reg4水平，将该水平与参比试样(通常是正常对照)中观察到的水平相比较。样品中的高reg4水平表示该受试者患有胰腺癌症或处于发生胰腺癌症的危险中。术语"正常对照水平，，表示与正常、健康的个体，或与已知未患有胰腺癌症的个体的群体相关的水平。可以利用免疫测定(例如elisa)检测reg4蛋白来测定reg4水平。源自受试者的血液样品可来自于全血、血清和血浆，所述全血、血清和血浆来源于受试者，例如已知或怀疑患有胰腺癌症的患者。另外，本发明提供进一步包括如下步骤的上述方法测定源自受试者的血液样品中ca19-9的水平，将ca19-9水平与参比^样(通常是正常对照)中观察到的水平相比较。本发明人发现，通过考虑rbq^和ca19-9两者的水平，可以更灵敏地鉴定患有胰腺癌症的患者。此外，本发明还提供包含抗-reg4抗体的、用于检测reg4的免疫测定试剂。抗-reg4抗体可包括多克隆抗体和单克隆抗体，或者至少两种识别彼此不同的reg4抗原决定簇的单克隆抗体。最后，本发明还提供检测胰腺癌症的试剂盒，包括(i)用于测定血液样品中reg4水平的免疫测定试剂；和(ii)reg4的阳性对照样品。所述试剂盒可进一步包括(iii)用于测定血液样品中ca19-9水平的免疫测定试剂；和(iv)ca19-9的阳性对照样品。根据以下的详细说明和权利要求，本发明的其它特征和优点将显而易见。应该理解的是，上述
发明内容和以下的详细说明都是优选的实施方案，不限制本发明或本发明其它备选的实施方案。图1显示了(a)针对显微解剖的pdac细胞(1-12)中和爿ct5的mrna表达的rt-pcr,与也经过显微解剖的正常胰腺导管上皮细胞(n)比较；和(b),在利用抗-reg4抗体的免疫组织化学研究中，在一些pdac细胞中强染色(上图面，原始放大率x200)。在细胞质观察到reg4的阳性染色。在正常胰腺组织中，腺泡细胞显示弱染色(下图面，原始放大率x200)，但在正常的导管上皮细胞和胰岛细胞中不显示染色。图2显示了用于reg4水平检测的夹心elisa的标准曲线。图3显示了123名健康人中reg4水平的分布。血清reg4浓度用elisa方法测定。图4显示了7名患有可切除的pdac患者术前和术后的血清reg4水平。白条，术前；黑条，术后。推定血清reg4的正常范围为9.0ng/ml(虛线)以下。图5显示了用于测定reg4水平的改良夹心elisa的标准曲线。图6显示了(a)利用reg4或ca19-9作为标志物的诊断结果表；和(b)reg4阳性群体和ca19-9阳性群体之间重叠的venn图。" "4戈表阳性结果；"-，，代表阴性结果。有59个胰腺癌症样品，29个reg4阳性样品和45个ca19-9阳性样品。其中，22个样品对reg4和ca19-9都呈阳性，7个样品对reg4和ca19-9呈阴性。图7显示了利用每种用于测定reg4水平的抗reg4单克隆抗体(克隆21-1、24-1、34-1)的夹心elisa的标准曲线。图8描述了9名胰腺癌症患者和28名健康人血清中reg4蛋白的检测。本发明的具体实施例方式除非另有特定的说明，本说明书中使用的术语"一个(a)"或"一种(an)"和"该(the)"是指至少一个或至少一种。在本发明中，将reg4—reg源自再生中的胰岛(regeneratingislet-derived)家力美(hartupeejc,efa/.,(2001)biochimbiophysacta.;1518(3):287-93)的一个新成员一鉴定为胰腺癌症的生物标志物。本发明人已经报道了显微解剖的胰腺癌症细胞的全基因组cdna微阵列(nakamurat，(2004)oncogene.;23(13):2385-400)。尽管在所述报道中，发现reg4在胰腺癌症细胞中过表达，但没有提供关于血中reg4水平如何与胰腺癌相关的证据。reg家族是与消化器官中组织再生和炎症有关的分泌型分子(hartupeejc，"a/"(2001)biochimbiophysacta.;1518(3):287-93.,watanabet，a/"(19卯)jbiolchem.;265(13):7432-9"u翻m,da/"(1992)advexpmedbiol,;321:61-6;discussion67-9),而且reg家族在几种胃肠道癌症中是上调的(u腸m,da/"(1992)advexpmedbiol.;321:61-6;discussion67-9"lasserrec，a/.，(1992)cancerres.;52(18):5089-95.,kamarainenm，e^/.，(2003)amjpathol.;163(1):11-20),并可能作为营养因子或抗细胞凋亡因子在癌症中发挥作用(lasserrec,"a/.,(1992)cancerres.;52(18):5089-95),但是仍不清楚它们的病理生理学功能，特别是新成员reg4的功能和表达模式。本发明人已生产出reg4特异性抗体，并且通过利用抗reg4抗体的免疫组织化学验证了其在pdac细胞中的过表达。此外，本发明人建立了夹心elisa系统以测量pdac患者血清中的reg4水平，证明了reg4作为胰腺癌症的新血清学标志物的应用。it断胰月泉癌症通过测量源自受试者的血液样品中的reg4水平，可以确定受试者中胰腺癌症的发生或者发展成胰腺癌症的倾向(predisposition)。因此，本发明涉及确定(例如测量)血液样品中reg4水平。在本发明中，诊断胰腺癌症的方法还包括检验或检测胰腺癌症的方法。或者，在本发明中，诊断胰腺癌症还指显示受试者中患胰腺癌症的怀疑、风险或可能性。任何血液样品都可以用于4全测reg4水平，只要所述样品中可^r测出愿g4基因或reg4蛋白。优选地，所述血液样品包含全血、血清和血浆。在本发明中，"血液样品中reg4水平，，指已对全血中血细胞体积(corpuscularvolume)校正后血中存在的reg4的浓度。技术人员将认识到，个体间血中血细胞体积的比例变化很大。例如，全血中红细胞的比例在男性和女性之间明显不同。此外，个体间差异不容忽视。因此，某一物质在包含血细胞成分的全血中的表观浓度，根据血细胞体积的比例不同而变化很大。例如，即使血清中的浓度一样，有大量血细胞成分的样品的测定值也会比有少量血细胞成分的样品的值低。因此，为了比较血中成分的测定值，通常使用已经对血细胞体积进行了才交正的值。举例来说，通过从全血中分离血细胞获得血清或血浆，利用所述血清或血浆作为样品测量血中成分，可以获得已经消除来自血细胞体积的影响的测定值。因此，通常可以测定血清或血浆中的浓度来作为本发明中reg4的水平。或者，可以首先将其测定为全血中的浓度，然后可校正来自血细胞体积的影响。用于测量全血液样品中血细胞体积的方法是已知的。根据本方法诊断胰腺癌症的受试者优选哺乳动物，包括人、非人灵长目、小鼠、大鼠、犬、猫、马和牛。本发明优选受试者为人。在本发明中，受试者可以是怀疑患有胃肠系统(例如胰腺)癌症的患者或者是健康个体。可以利用本发明诊断患者以促进临床决策。在另一实施方案中，也可以将本发明应用于健康个体以筛查胃肠系统(即胰腺)的癌症。在本发明的一个实施方案中，通过测量血液样品中reg4蛋白的量或浓度来确定reg4水平。测定血液样品中reg4蛋白量的方法包括免疫测定法。在本发明的诊断方法中，除了reg4的血液浓度夕卜，还可以测定ca19-9的血液浓度以检测胰腺癌症。因此，本发明4是供诊断胰腺癌症的方法，其中，当reg4的血液浓度或ca19-9的血液浓度之一，或者两者都高于健康个体时，则检出胰腺癌症。众所周知，ca19-9是胰腺癌、结肠癌、胃癌和卵巢癌的血清学肿瘤标志物。ca19-9的表位是糖蛋白(黏蛋白)上的糖脂，其相当于有附加的唾液酸残基的lewis(a)血型决定簇。该抗原由针对在人结肠直肠癌细胞系中发现的决定簇所制备的单克隆抗体来定义。除了成人胰腺、唾液导管、胃和结肠上皮、胰液、胃液、唾液和胎粪外，在正常胎儿組织中也发现了这种抗原。ca19-9通过胆道系统从循环中移除。这种抗原在有基因型lewis(a-b-)的人(相当于约5%的人口)中不表达。如上所述，已经将ca19-9用作诊断或检测胰腺癌症的血清学标志。但是ca19-9作为胰腺癌症标记物的灵敏度，对于完全检测胰腺癌症而言还有一定不足。因此，需要提高诊断胰腺癌症的灵敏度。在本发明中，提供一种用于胰腺癌症的新型血清学标志物——reg4。通过本发明，可以改善胰腺癌症的诊断或检测方法的灵敏度。即，本发明提供一种诊断受试者中胰腺癌症的方法，包括如下步骤(a)从待诊断的受试者收集血液样品；(b)测定血液样品中的reg4水平；(c)将步骤(b)中测定的reg4水平与正常对照的reg4水平相比较，其中与正常对照相比，血液样品中的高reg4水平表示该受试者患有胰腺癌症。在优选的实施方案中，本发明的诊断或检测方法可进一步包括如下步骤(e)测定血液样品中的ca19-9水平；(f)将步骤(e)中测定的ca19-9水平与正常对照的ca19-9水平相比较；和(g)判断与正常对照相比血液样品中高reg4水平和/或高ca19-9水平表示该受试者患有胰腺癌症。通过reg4和ca19-9的组合，可以显著提高检测胰腺癌的灵敏度。例如，在下面讨论的实际实施例所分析的组中，胰腺癌症的ca19-9阳性率为约76.3%。与之相比，reg4和ca19-9的组合的阳性率增加至88.1%(图6)。在本发明中，"reg4和ca19-9的组合"指用ca19-9水平和reg4水平中的任一种或者同时用两者作为标记物。在优选的实施方案中，可判断ca19-9和reg4中任一种阳性的患者有较高的患胰腺癌组合的危险。应用reg4和ca19-9的组合作为胰腺癌症血清学标志是新颖的。因此，与根据单独测量ca19-9的结果进行的测定相比，本发明可大大改善检测胰腺癌症患者的灵敏度。这种改善背后的事实是，ca19-9阳性患者组和reg4阳性患者组不是完全一致的。进一步描述这个事实，具体如下。首先，根据ca19-9测量的结果有比标准值更低的值(即未患有胰腺癌症)的患者中，实际上有一定比例的患者患有胰腺癌症。所述患者称为ca19-9假阴性患者。通过将基于ca19-9的检测和基于reg4的检测结合，可以从ca19-9假阴性患者中发现reg4值高于标准值的患者。换句话说，本发明提供一种手段，从因ca19-9的血液浓度低而被错误地确定为"阴性的"患者中，鉴定出事实上患有胰腺癌症的患者。因此本发明提高检测胰腺癌患者的灵敏度。通常，简单地结合利用多种标记物测定的结果可以增加检测灵敏度，但另一方面，其常常导致特异度降低。然而，本发明通过确定灵敏度和特异度之间的最佳平衡，已确定了一种特征性组合，其可以增加检测灵敏度而不损害特异度。在本发明中，为了同时考虑ca19-9测量的结果，可以例如测量ca19-9的血液浓度并将其与标准值相比较(以与上述reg4的测定值与标准值之间的比较相同的方式)。例如，如何测量ca19-9的血液浓度并将其与标准值比较是已知的。此外，用于ca19-9的elisa试剂盒也是商业上可得到的。这些在已知报道中描述的方法可用在本发明的方法中以诊断或4企测胰腺癌症。在本发明中，reg4血液浓度的标准值可通过统计学方法确定。例如，可以测量健康个体中reg4的血液浓度，以通过统计学方法确定reg4的标准血液浓度。当形成统计学上充足的群体时，常常用相对于平均值2倍或3倍标准偏差(s.d.)范围的值作为标准值。因此，相当于平均值 2xs.d.或平均值 3xs.d.的值可用作标准值。所述设定的标准值理论上分别包括90%和99.7%的健康个体。或者，也可以根据胰腺癌症患者中reg4的实际血液浓度设定标准值。通常，以这种方法设定的标准值使假阳性的比例减到最小，所述标准值从满足能够使检测灵敏度达到最大的条件的一定范围的值中选择。本说明书中，"假阳性比例"指健康个体中，reg4的血液浓度被判断为高于标准值的患者的比例。相反，健康个体中，reg4的血液浓度被判断为低于标准值的患者的比例表示特异度。即，假阳性比例和特异度的和总是1。"检测灵敏度"指在已经确定存在胰腺癌症的个体的群体里的所有胰腺癌症患者中，reg4的血液浓度被判断为高于标准值的患者的比例。此外，在本发明中，reg4的血液浓度被判断为高于标准值的患者中胰腺癌症患者的比例代表阳性预测值。另一方面，reg4的血液浓度被判断为低于标准值的患者中健康个体的比例代表阴性预测值。所述这些值之间的关系总结于表l。正如如下所示的关系所表明的，灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，这些值(它们都是评估胰腺癌症的诊断准确度的指标)中每一个都随着用于判断reg4血液浓度水平的标准值而变化。表1tableseeoriginaldocumentpage12
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正如已经提到的，通常设定一个标准值以使假阳性率低，灵敏度高。但是，由上述所示的关系也明显可见，假阳性率与灵敏度之间有一个权衡取舍的关系。即，如果标准值降低，则检测灵敏度增加。然而，由于假阳性率也增加，所以很难满足具有"低假阳性率"的条件。鉴于这种情况，举例来说，可以选择产生下列预测结果(predictedresult)的值作为本发明的优选标准值。假阳性率是50%或更低的标准值(即特异度不低于50%的标准值)。灵敏度不低于20%的标准值。在本发明中，可以利用接受者搡作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲线来设定标准值。roc曲线是一个纵轴显示检测灵敏度，横轴显示假阳性率(即"1-特异度")的曲线图。在本发明中，可通过连续地改变用于检测reg4血液浓度高/低程度的标准值后，将灵敏度和假阳性率的变化作图来获得roc曲线。用于获得roc曲线的"标准值"是一个临时用于统计学分析的值。用于获得roc曲线的"标准值，，通常可以在一个可覆盖所有可选择的标准值的范围内连续地变化。例如，标准值可在被分析的群体中最小和最大的reg4测定值之间变化。基于获得的roc曲线，欲用于本发明的优选的标准值可以选自满足上述条件的范围。或者，可以根据roc曲线选择标准值，所述roc曲线通过使标准值在包含大多数reg4测定值的范围内变化而产生。可以用任何可定量蛋白质的方法来测量血中的reg4。例如，本发明中可应用免疫测定、液相色谱法、表面等离子体共振(spr)、质谱法等。在质谱法中，可通过使用合适的内标来定量蛋白质。例如，同位素标记的reg4可用作内标。血液中reg4的浓度可以由血液中reg4的峰强度和内标的峰强度确定。通常，基质辅助激光解吸电离(maldi)方法用于蛋白质的质谱法。通过利用质谱法或液相色谱法的分析方法，也可以将reg4与其它肿瘤标志物(例如ca19-9)同时分析。本发明中一种优选的测量reg4的方法是免疫测定。reg4的氨基酸序列是已知的(genbank登录号ay126670)。reg4的氨基酸序列显示在seqidn0:14,编码它的cdna的核苷酸序列显示在seqidno:13。因此，本领域技术人员可以通过根据reg4的氨基酸序列合成必要的免疫原来制备抗体。利用肽合成仪可容易地合成用作免疫原的肽。所述合成肽可以通过与载体蛋白连接而用作免疫原。钥孔血蓝蛋白(klh)、肌红蛋白、白蛋白等可以用作载体蛋白。优选的载体蛋白是klh、牛血清白蛋白等。通常使用马来酰亚胺苯曱酰-n-氛3虎3白醜亚胺國旨(maleimidobenzoyl-n—hydrosuccinimideester)方'法(下文纟宿写为mbs方法)等将合成肽与载体蛋白连接。具体地，将半胱氨酸引入合成肽，利用半胱氨酸的sh基团通过mbs将所述肽与klh交联。可以在所述合成肽的n-末端或c-末端引入半胱氨酸残基。或者，可以利用reg4的核香酸序列(genbank登录号ay126670)或其一部分制备reg4。可以利用由表达reg4的组织制备的mrnas来克隆包含必要的核苷酸序列的dna。或者，可以用商业上可得到的cdna文库作为克隆来源。获得的reg4的遗传重组体或其片段也可以用作免疫原。优选用这种方式表达的reg4重组体作为免疫原，获得用于本发明中的抗体。商业上可得到的reg4重组体(prospec-tanytechnogeneltd.,productno:pro-424)也可以用作免疫原。将用这种方式获得的免疫原与适当的佐剂混合，用来免疫动物。已知的佐剂包括弗氏完全佐剂(fca)和不完全佐剂。以适当的时间间隔重复免疫程序，直到确定抗体滴度增加。本发明中对免疫动物无特殊限定。具体地，可以应用通常用于免疫的动物例如小鼠、大鼠或兔。当获得抗体为单克隆抗体时，可以使用有利于其生产的动物。例如在小鼠中，许多用于细胞融合的骨髓瘤细胞系是已知的，用于高概率地建立杂交瘤的技术也已是众所周知的。因此，小鼠是用来获得单克隆抗体的理想免疫动物。此外，免疫处理不限于体外处理。也可采用在体外对培养的免疫活性细胞进行免疫致敏的方法。转化并克隆用这些方法获得的抗体产生细胞。用于转化抗体产生细胞以获得单克隆抗体的方法不限于细胞融合。例如，通过病毒感染获得可克隆的转化体的方法是众所周知的。可以根据产生用于本发明的单克隆抗体的杂交瘤对reg4的反应性来对其进行筛选。具体地，首先利用针对用作免疫原的reg4(或其域肽)的结合活性作为指标来选择抗体产生细胞。根据需要对通过所述筛选所选择的阳性克隆进行亚克隆。可以通过在适当的条件下培养已建立的杂交瘤并收集产生的抗体来获得欲用于本发明的单克隆抗体。当杂交瘤是同种杂交瘤(homohybridoma)时，可以将它们在同系动物中腹膜内接种从而在体内培养。在此情况下，收集腹水作为单克隆抗体。当使用异种杂交瘤时，可以用棵鼠作为宿主在体内培养它们。除体内培养外，还经常在适当的培养环境下离体培养杂交瘤。例如，基本培养基例如rpmi1640和dmem通常用作杂交瘤的培养基。可以将添加剂(例如动物血清)添加到所述培养基中以使抗体产生能力维持在高水平。当离体培养杂交瘤时，可收集培养上清作为单克隆抗体。可以通过培养后与细胞分离，或者通过采用中空纤维的培养设备培养时连续收集，来收集培养上清。用饱和硫酸铵沉淀分离免疫球蛋白级分，并进一步用凝胶过滤、离子交换层析等纯化，从而由作为腹水或培养上清收集的单克隆抗体制备用于本发明的单克隆抗体。此外，如果单克隆抗体是iggs,则基于蛋白a或蛋白g柱亲和层析的纯化方法是有效的。可用在本发明的免疫测定中的单克隆抗体的一个例子是小鼠单克隆的克隆21-1抗体。更具体地说，优选小鼠单克隆的克隆21-1抗体，或包含其可变区的抗体片段，作为用在本发明的免疫测定中的单克隆抗体。例如，单克隆的克隆21-1抗体，或具有与这种抗体等效的抗原结合活性的单克隆抗体，可作为固定化抗体用于基于夹心法的免疫测定。在本发明一个优选的实施方案中，可以通过夹心法测量reg4，所述夹心法使用固定化到载体上的单克隆抗体和标记的多克隆抗体。这样的抗体的组合是允许高灵#文度检测reg4的优选组合。单克隆的克隆21-1抗体的vh和vl的氨基酸序列分别显示于seqidnos:16和24。本领域技术人员可以基于所述氨基酸序列信息通过基因工程生产具有相同结合活性的单克隆抗体。此外，可以通过将vh和vl的cdr1、cdr2和cdr3移植到其它免疫球蛋白的框架中，来重建具有相等抗原结合活性的抗体。克隆21-1的vh和vl的cdr由如下所示的氨基酸序列组成。每个氨基酸序列由如下显示的seqidno的核苦酸序列编码。因此，用包含所述核苷酸序列的dna取代其它免疫球蛋白的相应cdr,可以将克隆21-1的抗原结合活性移植到其它免疫球蛋白。重链核苷酸序列cdr1seqidno:17cdr2seqidno:19cdr3seqidno:21轻链cdr1seqidno:25cdr2seqidno:27cdr3seqidno:29氨基酸序列seqidno:18seqidno:20seqidno:22seqidno:26seqidno:28seqidno:30本发明提供的克隆21-1是一种新型单克隆抗体，其对于reg4的免疫测定是有用的。因此，本发明提供包含上述氨基酸序列作为cdrs的抗-reg4单克隆抗体。本发明的单克隆抗体优选包含seqidnos:16和24的氨基酸序列，分别作为vh和vl的氨基酸序列。可以将编码氨基酸序列的dna整合在适当的表达载体中从而表达在其可变区包含seqidno:16和24的氨基酸序列的免疫球蛋白。通过将所述dna连同编码恒定区dna—起表达，也可获得带有恒定区的免疫球蛋白。在本发明的免疫测定中，带有恒定区的完整的免疫球蛋白可以用作抗体，或者带有抗原结合区的免疫球蛋白片段也可以用作抗体。可将信号序列加至可变区的n-末端以从宿主细胞分泌表达产物。vh和vl的氨基酸序列(信号序列已加至所述氨基酸序列)分别显示于seqidno:32和34,编码所述氨基酸序列的核苷酸序列分别显示于seqidnos:31和33。另一方面，为了获得作为多克隆抗体用于本发明的抗体，从免疫后抗体滴度增加的动物抽取血，分离血清以获得抗血清。用已知的方法乂人抗血清纯化免疫球蛋白，以制备用于本发明的抗体。reg4特异度抗体可以通过免疫亲和层析(用reg4作为配体)和免疫球蛋白纯化的联用来制备。当针对reg4的抗体与reg4接触时，抗体与抗原决定簇(表位)结合，抗体通过抗原-抗体反应识别抗原决定簇。可以用各种免疫测定方法检测抗体与抗原的结合。免疫测定大致上可分为异源分析方法和同源分析方法。为了使免疫测定的灵敏度和特异度维持在较高水平，使用单克隆抗体是理想的。具体解释本发明用各种免疫测定形式测量reg4的方法。首先，描述用异源免疫测定测量reg4的方法。在异源免疫测定中，需要一种机制，用于在将能结合reg4的抗体与不能结合reg4的抗体分离后，检测能结合reg4的抗体。为了促进分离，通常使用固定化试剂。例如，首先制备其上已固定有识别reg4的抗体的固相(固定化抗体)。使reg4与所述固定化抗体结合，进一步使第二抗体与其反应。当将固相与液相分开并进一步洗涤时，必要时，第二抗体与reg4的浓度成比例地保留在固相上。通过标记第二抗体，可以测量源自标记的信号/人而对reg4定量。可以使用任何方法使抗体结合到固相。例如，抗体可物理吸附到疏水性材料上，例如聚笨乙烯。或者，抗体可化学结合到多种表面具有官能团的材料上。此外，可以利用结合配体的结合伴侣来捕获用该配体标记的抗体，使其结合到固相上。结合配体与其结合伴侣的结合包括抗生物素蛋白-生物素等。可以在第一抗体与reg4之间反应的同时或之前将固相与抗体偶联。同样地，不需要直接标记第二抗体。即，可以用针对抗体的抗体或用结合反应(例如抗生物素蛋白-生物素)间接标记第二抗体。样品中reg4的浓度根据用已知reg4浓度的标准样品获得的信号强度来测定。可以使用任何抗体作为用于上述异源免疫测定的固定化抗体和第二抗体，只要所述抗体是识别reg4的抗体或其包含抗原结合位点的片段。因此，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体，或者两者的混合物或组合。例如，单克隆抗体和多克隆抗体的组合是本发明中优选的组合。或者，当两种抗体都是单克隆抗体时，优选组合识别不同表位的单克隆抗体。由于欲测量的抗原被夹在抗体之间，所以这样的异源免疫测定称为夹心法(sandwichmethods)。由于夹心法在测量灵壽文度和重现性方面有优势，所以它们是本发明中优选的测量原理。于样品中的reg4竟争性抑制已知浓度的reg4与抗体的结合这样一种现象的免疫测定。通过标记已知浓度的reg4并测定与抗体反应(或不反应)的reg4的量，可以确定样品中reg4的浓度。当已知浓度的抗原和样品中的抗原同时与抗体反应时，竟争反应系统成立。此外，当使抗体与样品中的抗原反应，其后与已知浓度的抗原起反应时，基于抑制反应系统的分析是可能的。在所述两种类型的反应系统中，通过将抗体或者用作试剂成分的已知浓度的抗原中的任一种设定为标记成分，并将另一种设定为固定化试剂，可以构建可操作性优异的反应系统。放射性同位素、荧光物质、发光物质、具有酶活性的物质、肉眼可观测的物质、磁性可观测的物质等用于所述异源免疫测定。这些标记物质的具体例子如下所示。具有酶活性的物质过氧化物酶，碱性磷酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡糖氧化酶，乳酸脱氢酶，或淀粉酶，等荧光物质异硫氰酸荧光素，四曱基罗丹明异硫氰酸盐或酯，取代的罗丹明异硫氰酸盐或酯，或二氯三。秦异硫氰酸盐或酯，等放射性同位素氮，1251,或1311，等其中，非放射性标记例如酶是在安全性、可操作性、灵敏度等方面有利的标记。可以用已知方法例如高碘酸方法或马来酰亚胺方法将酶标记与抗体或reg4连接。珠子、容器内壁、细颗粒、多孔载体、磁性粒子等用作固相。可以应用例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基曱苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚曱基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂糖、玻璃、金属、陶瓷等材料形成的固相。已将用于化学结合抗体等的官能团引入上述固体材料的表面上，这样的固体材料也是已知的。已知的结合方法，包括化学结合(例如多聚-l-赖氨酸或戊二隧处理)和物理吸附，也可应用于固相和抗体(或抗原)。虽然在本说明书例示的所有异源免疫测定中都需要将固相与液相分离的步骤和洗涤步骤，但是可以利用免疫层析方法(这是夹心法的一种变化)容易地进行这些步骤。具体地，将欲固定的抗体固定到能利用毛细现象运送样品溶液的多孔载体上，然后在其中利用所述毛细现象展开包含reg4和经标记的抗体的样品混合物。展开期间，reg4与经标记的抗体反应，当其进一步与固定化抗体接触时，其在那个位置被捕获。不与reg4反应的经标记抗体不被固定化抗体捕获而通过。结果，利用保留在固定化抗体位置的经标记的抗体的信号作为指标，可以检测出reg4的存在。如果预先使经标记的抗体保留在多孔载体中的上游，则可仅通过滴加样品溶液启动和完成所有反应，可构建非常简单的反应系统。在免疫层析方法中，可以结合肉眼可区分的标志成分(例如着色粒子)，以构建甚至不需要特殊读取装置的分析设备。此外，在免疫层析方法中，可调节reg4的检测灵敏度。例如，通过调节如下所述的截断值附近的检测灵敏度，可以在超出截断值时检出上述标记成分。使用这样一种设备，可以很简单地判断受试者是阳性的还是阴性的。采用可肉眼区分标记的构造，可以简单地将血液样品加样于免疫层析设备而获得必要的试验结果。将用于调节检测灵敏度的第二固定化抗体置于加样位置和固定化抗体之间(特开平6-341989(公布未审查的日本专利申请))。当样品中的reg斗从加样位置向用于标记检测的第一固定化抗体的位置展开时，被第二固定化抗体捕获。第二固定化抗体饱和后，reg4可到达位于下游的第一固定化抗体的位置。结果，当样品中包含的reg4浓度超过预定浓度时，在第一固定化抗体的位置检测到与经标记的抗体结合的reg4。其次，说明同源免疫测定。与如上所述需要分离反应溶液的异源免疫学分析方法相对，还可利用同源分析方法测量reg4。同源分析方法允许检测抗原-抗体反应产物，而无需将它们从反应溶液分离。一种代表性的同源分析方法是免疫沉淀反应，其中通过检测抗原-抗体反应后产生的沉淀来定量分析抗原成分。多克隆抗体通常用于免疫沉淀反应。当应用单克隆抗体时，优选使用能与不同reg4表位结合的多种类型的单克隆抗体。免疫学反应后的沉淀反应的产物可由肉眼观测，或可通过光学测量转换成数值数据。免疫学粒子凝集反应是一种通用的同源分析方法，利用抗体致敏的细颗粒在抗原作用下的凝集作为指标。与上述免疫沉淀反应中一样，多克隆抗体或多种类型单克隆抗体的组合也可用在这种方法中。细颗粒的抗体致敏可以用抗体混合物致敏，或者可以通过混合分别用每种抗体致敏的粒子来制备这样的细颗粒。用这种方式获得的细颗粒一旦与reg4接触就产生基质样反应产物。反应产物可以作为粒子聚集来检测。粒子聚集可由肉眼观测或通过光学测定转换成数值数据。基于能量转移和酶引导作用(enzymechanneling)的免疫测定方法是已知的同源免疫测定法。在使用能量转移的方法中，将具有供体/受体关系的不同的光学标记分别接到能够识别抗原上靠近的表位的多种抗体上。当发生免疫反应时，两个部分相互接近，发生能量转移现象，其结果是产生荧光淬灭或者荧光波长的改变等信号。另一方面，酶引导作用为能够结合邻近的表位的多种抗体使用标记，其中所述标记是具有这样的关系的酶的组合，即一种酶的反应产物是另一种酶的底物。当两个部分由于免疫反应彼此靠近时，促进酶反应，从而它们的结合可以作为酶反应速率的变化被检测到。在本发明中，可以从抽取自患者的血液制备用于测量reg4的血液。优选的血液样品是血清或血浆。测量前可将血清或血浆样品稀释。或者，可以将全血作为样品测量，然后可一交正得到的测定值以确定血清浓度。例如，全血中的浓度可通过测定同一血液样品中血细胞体积的比例来校正至血清浓度。在一个优选的实施方案中，免疫测定包括elisa。本发明人建立了夹心elisa以;险测患有可切除pdac的患者中血清reg4。然后将血液样品中reg4水平与和标准样品(例如正常对照样品)有关的reg4水平相比较。短语"正常对照水平"指在未患有胰腺癌症的群体的血液样品中通常发现的reg4水平。优选具有与试验样品相似性质的标准样品。例如，如果试验样品包含患者血清，标准样品也应是血清。来自于对照和试验受试者的血液样品中reg4水平可以同时测定，或者，作为选择，可以根据分析先前从对照组收集的样品中reg4水平得到的结果，用统计学方法测定正常对照水平。reg4水平还可以用于监测胰腺癌症的疗程。在该方法中，由接受胰腺癌症治疗的受试者提供试验血液样品。优选地，在治疗前、治疗期间或治疗后的不同时间点从受试者获得多个试验血液样品。然后可以将治疗后样品中reg4水平与治疗前样品中reg4水平相比较，或者，作为选择，与标准样品(例如正常对照水平)相比较。例如，如果治疗后reg4水平比治疗前reg4水平低，则可以做出治疗有效的结论。同样地，如果治疗后reg4水平与正常对照reg4水平相似，则也可以^:出治疗有效的结"^仑。"有效的"治疗是导致受试者中reg4水平降低，或胰腺癌症的大小、患病率或转移潜能降低的治疗。当预防性地应用治疗时，"有效的"意味着治疗延緩或阻止胰腺癌症的发生，或减轻胰腺癌症的临床症状。可以利用标准临床规程评估胰腺癌症。此外，可以结合任何已知诊断和治疗胰腺癌症的方法来确定治疗的有效性。例如，以组织病理学方法或通过鉴别症状异常来常规诊断胰腺癌症。根据从如下所述实施例得到的结果，由本发明提供的胰腺癌血清学标志reg4在患有除了胰腺癌症之外的癌症的患者中也可以显示高测定值。具体地，尤其对于胃癌症和结肠癌症观察到较高的血液浓度。通过胃癌症(ouen"""/.，(2005)j.pathol"207(2):185-98)和结肠癌症(violettes""a/.，(2003)int.j.cancer,103(2):185-93)中的免疫组织化学染色实际证实了较高的reg4表达。然而，利用其它诊断指标可以很容易地排除患有这些癌症的可能性。因此，根据reg4或ca19-9和reg4的结合判断为患有胰腺癌症的患者也患有胃癌症或结肠癌症的可能性也可以很容易地排除。早期胰腺癌症的诊断和检测非常难，而其它胃肠(gi)恶性肿瘤的诊断或筛查已通过本领域众所周知的内镜或其它非侵入方法(如大便潜血和血清胃蛋白酶原)建立。如果应用本申请要求保护的方法来筛查gi疾病和检测高水平的血清reg4，则可以应用内镜程序——其已被承认为可靠且灵敏的方法一一来检测gi疾病。如果内镜检查没有在胃或结肠直肠中检测出明显的致病性病变，可以随后应用侵入性或非侵入性诊断程序〔内镜逆行胰胆管造影(ercp)、内镜超声检查(eus)、磁共振胰胆管造影术(mrcp)等〕检测早期胰腺癌症。但现有技术没有提供任何用于筛查早期胰腺癌症的可靠工具。为了筛查其它gi恶性肿瘤，通常利用大便潜血和血清胃蛋白酶原。通过与其它血清学标志(例如ca19-9)和入侵性内镜程序结合，本发明要求保护的方法是筛查胰腺癌症的有用工具。可以预先将根据本发明用于进行胰腺癌症诊断的成分组合，作为检测试剂盒提供。据此，本发明提供一种用于检测胰腺癌症的试剂盒，包括(i)用于才全测血液才羊品中reg4水平的免疫测定试剂；和(ii)reg4的阳性对照样品。在优选的实施方案中，本发明的试剂盒可进一步包括(iii)用于斥企测血液样品中ca19-9水平的免疫测定试剂；和(iv)ca19-9的阳性对照样品。组成本发明试剂盒的免疫测定用试剂可以包括如上所述各种免疫测定所必需的试剂。具体地，免疫测定用试剂包括能识别待测量物质的抗体。可以根据免疫测定的测定形式修饰所述抗体。elisa可用作本发明优选的测定形式。在elisa中，例如，通常应用固定到固相上的第一抗体和带有标记的第二抗体。因此，用于elisa的免疫测定试剂可以包括固定在固相载体上的第一抗体。细颗粒或反应容器内壁可以用作固相载体。磁性粒子可以用作细颗粒。或者，多孔板(例如96孔微量培养板)常常用作反应容器。用于处理大量样品的容器也是众所周知的，其带有高密度的、比96孔微量培养板体积小的孔。在本发明中，这些反应容器的内壁可以用作固相载体。用于elisa的免疫测定试剂可进一步包括带有标记的第二抗体。用于elisa的第二抗体可以是直接或间接地与酶连接的抗体。将酶化学连接到抗体的方法是已知的。例如，可以酶切免疫球蛋白以获得包括可变区的片段。通过使所述片段中包含的-ss-键还原成-sh基，可以附接上双功能接头。预先将酶与双功能接头连接，可以使酶与抗体片段连接。或者，为了间接连接酶，例如，可以使用抗生物素蛋白-生物素结合。即，可以通过使生物素化的抗体与附接着有抗生物素蛋白的酶接触，使酶间接地与抗体连接。另外，利用第三抗体(一种识别第二抗体的酶标抗体)可以使酶间接地与第二抗体连接。例如，如上述例示的那些酶可用作标记抗体的酶。本发明的试剂盒包括reg4的阳性对照。reg4的阳性对照包括预先测定了浓度的reg4。优选浓度为，例如，在本发明的试验方法中设定为标准值的浓度。或者，也可以组合具有更高浓度的阳性对照。本发明中reg4的阳性对照还可包括预先测定了浓度的ca19-9。优选包括reg4和ca19-9两者的阳性对照作为本发明的阳性对照。因此，本发明提供一种用于检测胰腺癌症的阳性对照，其包括浓度超过正常值的reg4和ca19-9。或者，本发明涉及包含浓度超过正常值的reg4和ca19-9的血液样品在用于4企测胰腺癌症的阳性对照的生产中的用途。已知ca19-9可以用作胰腺癌症的指标；然而，reg4可以用作胰腺癌的指标是本发明获得的新发现。因此，除包含ca19-9外还包含reg4的阳性对照是新颖的。本发明的阳性对照可以通过将浓度超过标准值的ca19-9和reg4添加到血液样品中来制备。例如，包含浓度超过标准值的ca19-9和reg4的血清作为本发明的阳性对照是优选的。本发明中的阳性对照优选是液体形式的。在本发明中，使用血液样品作为样品。因此，用作对照的样品也需要是液体形式。或者，使用时以预先定量的液体溶解干燥的阳性对照，可以制备提供试验浓度的对照。将干燥的阳性对照与溶解它所必需的一定量液体一起包装，使用者可仅通过将它们混合而获得必需的阳性对照。用作阳性对照的reg4可以是天然来源的蛋白质，或者其可以是重组蛋白。同样地，对于糖抗原ca19-9，天然来源的糖抗原或化学合成的唾液酸化lewis型糖抗原可以用作对照。不仅是阳性对照，阴性对照也可以组合在本发明的试剂盒中。用阳性对照或阴性对照来证实免疫测定显示的结果是正确的。下述实施例意在阐明本发明，并帮助本领域普通技术人员制造和使用相同的发明。实施例并不意欲以任何方式另外限制本发明的范围。除非另外限定，本说明书中使用的全部技术术语和科学术语均与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员一般理解的含义相同。尽管与本说明书中的所述类似或等同的方法和材料均可用于实施或检验本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本说明书中引用的任何专利、专利申请和出版物均并入本文作为参考。在下文，将利用实施例对本发明进行具体描述，但是并不解释成受其限制。实施例临床样品术前和术后(手术后一个月)血清样品在适当的知情同意规则下得自7例因胰腺腺癌而接受胰十二指肠切除术的患者。来自pdac的常规石蜡包埋组织切片在适当的知情同意规则下得自手术标本。血清样本得自59名胰腺癌症患者、35名其它胰腺疾病患者和56名正常健康供体。mg^的半定量rt-pcr分析pdac细胞和正常胰腺导管上皮细胞的纯化以前已有描述(nakamumt，"a/.,(2004)oncogene.;23(13):2385-400);用基于t7的体外转录(epicentretechnologies,madison,wi)对来自纯化的细胞群体的rna进行两轮扩增。通过监测作为定量对照的p-肌动蛋白g4c:re),本发明人制得了适合用于随后pcr扩增的各单链cdna的稀释物。引物序列为5'-catccacgaaactaccttcaact-3'(seqidno:l)和5'-tctccttagagagaagtggggtg-3'(seqidno:2)，用于5'-ccaattgctatggttacttcagg-3'(seqidno:3)和5'-gaaaaacaagcaggagttgagtg-3'(seqidno:4),用于朋gl所有反应在geneamppcrsystem9700(peappliedbiosystems,foster,ca)上，于如下条件下进行94。c预变性2min;和进行如下21个循环(用于爿c7s)或28个循环(用于朋g4):94°c30s，58°c30s和72°clmin。重组hreg4(rhreg4)的产生(l)表达盒载体的构建构建了在cmv启动子控制下利用ires共表达靶基因和嘌呤霉素-egfp融合蛋白的靶基因表达载体。kod-plus-(toyobo;kod-201)用于基因扩增的所有pcr过程。首先，利用5'-ttaattaactcgagggatcccccttcgaacaaaaactcatc-3'(seqidno:5)和5'陽ggcgagaaaggaagggaag画3'(seqidno:6)通过pcr从pcdna3.1/myc隱hisa(invitrogen;v800-2)扩增出myc-histag基因，将其插入pbluescriptiisk (toyobo)中的smal位点，以构建pblue/myc-his。然后，将用5'-atcagatctatggtgagcaagggcgagga-3'(seqidno:7)和5'-atcttacttgtacagctcgtccatgc-3'(seqidno:8)扩增的egfp基因插入pblue/myc-his中的ecorv位点来制备pblue/myc-his/egfp。另外，利用5'-aatagatatccgcccctctccctcccc-3'(seqidno:9)和5'画aataggatccggcaccgggcttgcg-3'(seqidno:10)从pqcxip(clontech;9136-l)扩增出ires-噪呤霉素基因序列，然后用ecorv和bamhi消化，并引入到pblue/myc-his/egfp的pmel-bglll位点中以构建pblue/myc-his/ires-puro-egfp。最后，用pad和ecorv酶切pblue/myc-his/ires-puro-egfp，用切得的myc-his/ires-puro-egfp基因片段取代pqcxip的paci-ecorv片段，以构建靶基因表达载体pqcxmfflpg。(2)reg4mh表达载体的构建利用5'-aatattaattaaggaagatggcttccagaagca-3'(seqidno:ll)和5'-aataggatcctggtcggtacttgcacagga-3'(seqidno:12)通过pcr扩增出reg4基因，然后将其插入pqcxmhipg的pacl-bamhi位点以构建pqc/reg4mh/ipg。(3)表达细胞系的建立应用pantropicretroviralexpressionsystem(clontech;k1063-l)建立4凡原表达细胞系。在胶原包被的100mm平皿上制得融合的gp2-293细胞(clontech;k1063-1),利用lipofectamine20004吏所述细胞与pqc/reg4mh/ipg和pvsv-g(clontech;k1063-l)每种11.2吗共转染。48小时后，收集包含病毒颗粒的上清，超速离心(18,q00rpm，1.5h，4。c)沉淀病毒，沉淀物悬于30jultne(50mmtris-hcl[ph7.8],130mmnacl,1mmedta)，从而制备反转录病毒载体溶液。用150jul含8)ig/ml溴化己二曱铵(sigma;h-9268)的dmem(sigma;d5796)-10�s稀释5pl反转录病毒载体溶液，以制备含病毒颗粒的培养基。使293t细胞在96孔板中生长至约40%融合，将其中的培养基用所述制备的含病毒颗粒的培养基取代，从而将pqc/reg4mh/ipg导入细胞。基因导入后，在含5吗/ml嘌呤霉素(sigma;p-8833)的dmem(sigma;d5796)-10�s中培养细胞以建立表达细胞系(reg4mh/293t)。(4)抗原的纯化收集约1l所述已建立的表达细胞系的培养上清，对其利用talon纯化试剂盒(clontech;k1253-l)纯化带his-标签的蛋白。然后用pbs透析所述纯化蛋白，并通过sds-page和western印迹法(westernblotting)确认。用proteinassaykitii(biorad;500-0002ja)测定蛋白质浓度。将所述蛋白质当作纯化抗原。多克隆抗体用佐剂(弗氏完全佐剂)乳化抗原溶液制得了用于注射的rhreg4蛋白。在兔中激发产生针对纯化的全长rhreg4蛋白的多克隆抗-reg4抗体(anti-reg4pab)(medical&biologicallaboratories,nagoya,japan)。抗血清的亲和提纯如下进行。将sepharose4b(amersham)树脂用溴化氰(bromocyan)溶液活化，并与rhreg4蛋白偶联。将经过滤的抗血清加入上述树脂后，用磷酸盐缓沖液(ph8.0)洗涤3次。rhreg4特异性抗体用甘氨酸-盐酸緩冲液(ph2.3)洗脱，tris-hcl(ph8.0)中和，用pbs透析。单克隆抗体(l)免疫balb/c小鼠(4周龄，雌性)(japanslc)用作待免疫动物，用足垫法进行免疫。将100pl调节至0.1mg/ml的免疫原与佐剂(完全佐剂(freund)mitsubishikagakulatronrm606-1)混合制得乳剂，分别向4只小鼠的两个足垫注射50pl乳剂。每三天(间隔两天)进行第二次和第三次(最终)免疫，第三次免疫三天后进行细胞融合。(2)细胞融合从两只经免疫小鼠的双足切下肿大的淋巴结，切开淋巴结，用镊子等挢出细胞，离心收集从淋巴结获得的细胞。然后按2:1至10:1的比例混入骨髓瘤细胞(p3u1)。混合物离心后，将用等体积rpmi(rpmi1640;sigmacatnor8758)稀释过的50%peg(peg4000;merckcatno1097270100)加至得到的沉淀中以进行细胞融合。洗涤后，将细胞悬于160ml补加了hat添加物(x50)(gibcocatno21060-017)的15�s-hat培养基中，铺入16个96孔板中，每孔200pl。三天后更换培养基，确认集落形成后(l-2周后)，利用免疫沉淀进行第一次筛选。。)免疫沉淀在深孔板的每个孔中准备50(il用pbs洗涤过的蛋白gsepharose珠子，将350ilil杂交瘤培养上清倾注到珠子上，4。c旋转下反应l小时。用pbs洗涤后，向每孔加入350|il培养上清(非特异性结合物质被蛋白gsepharose珠子所吸附)作为抗原，4°c旋转下进行抗原-抗体反应1小时。再用pbs洗涤平板。向每孔加入30^l2x样品緩冲液，煮沸以制备样品，用western印迹检测带标签的抗原从而选择能被免疫沉淀的克隆。(4)单克隆杂交瘤的制备用有限稀释法克隆所选择的杂交瘤以获得单克隆杂交瘤。将杂交瘤铺板于96孔板中，收集有单集落的孔的培养上清，通过上述的免疫沉淀确认了抗体活性。对活性得到确认的孔中的细胞进行增殖，获得克隆21-1、24-1和34-l，它们在免疫沉淀中呈强阳性。(5)抗体纯化将杂交瘤的培养上清以每秒一滴的速度上样到蛋白a柱上以吸附抗体，用pbs/0.1%nan3洗涤(直到用吸收分光光度计测量a280变为0.05或更低为止)，用0.5m精氨酸-盐酸緩冲液(ph4.1)洗脱吸附的抗体。在洗脱步骤中，立即向洗脱样品加入1/5体积的1mtris-hcl缓冲液(ph8.0)来中和。测量每个级分的a280后，将a280为0.1或更高的级分集中起来，在pbs中透析。透析后，根据下面的乂>式确定浓度浓度^a280x0.7[mg/ml]。免疫组织化学染色胰腺癌的组织微阵列切片(accumaxarray)购自petagene公司(韩国汉城)，其中31个pdac组织和2个内分泌肺瘤组织平行点样两份。将切片去石蜡化，并在ph6.0的枸橼酸盐缓沖液中于108。c高压灭菌15分钟。在曱醇稀释的0.33%过氧化氬中温育30分钟从而抑制内源性过氧化物酶活性。用胎牛血清温育封闭后，将切片与抗-reg4多克隆抗体室温温育1小时。pbs洗涤后，用过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白(envisionkit,dakocytomation，carpinteria，ca)进行免疫检测。最后用3,3'-二氨基联苯胺(dako)使反应物显影，用苏木精对细胞进行复染。利用针对reg4的多克隆抗体对另一系列pdac组织进行的免疫组织化学分析显示在癌细胞细胞质有reg4的强烈信号，而胰腺中的腺泡细胞显示了弱reg4的染色(图1b)。另外，用其它31个pdac组织的系列点样进行的组织微阵列显示，31个pdac中有15个表达高水平的reg4(数据未显示)。64个pdac中共35个(55%)显示由抗-reg4抗体阳性染色(数据未显示)。这个结果与先前显微解剖细胞的rna研究的结果一致。elisa试验系统(l)用于抗体评价的夹心elisa系统将c8maxinunc-immunobreakapartmodule(nunc)用作夹心elisa的微量培养板。将抗-reg4单克隆抗体(克隆21-1、24-1和m-l)用0.1m碳酸盐緩冲液(ph9.6)稀释到10吗/ml后，加入微量培养板(50|ul/孔)，4°c静置过夜，以通过物理吸附固定每种抗体。用1�s/pbs封闭(室温2小时)后，弃封闭液，剩余物风干制得试验板。样品用反应缓沖液(pbs,0.1%tween20，1%bsa,ph7.3)3希释5倍后，加入试'验板(50^l/孔)，室温反应1小时。用洗涤緩冲液(0.13%tween20,0.15mnacl/10mmnah2p04)洗涤4次后，用酶标抗体稀释剂(1�s，0.135mnac1/20mmhepes)将hrp标记的抗-reg4多克隆抗体调节至1.5吗/ml，每孔加入50^l。室温反应1小时后，用洗涤緩冲液洗板4次。每孔加入50ial酶底物溶液(mossinc.;tmbultrasensitivesubstrate)显色，30分钟后，每孔加入50)ul0.36nh2s04终止显色反应。测量吸光度(a450/a620),根据每个抗体的校正曲线计算血清中的reg4浓度(图7)。利用上述夹心elisa系统，测定了来自于9例胰^^癌症患者和28例y建康受试者的样品中reg4的浓度，以评价每个克隆的抗体滴度。与克隆21-1相比，克隆24-1和34-1的检测灵敏度低(图7)，并且胰腺癌症患者样品中的reg4仅在克隆21-1中能检测到(图8)。此外，在利用克隆21-1的夹心elisa系统测量的样品中，reg4的浓度显示出在胰腺癌症患者中的值比健康受试者中高，证实来自于健康受试者和胰腺癌症患者的样品中reg4浓度有显著性差异(po.05)(图8)。克隆21-1中可变区的氨基酸序列和每个cdr,以及编码它们的dna的核苷酸序列如下
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进一步，发现重链和轻链具有信号序列，分别示于seqidno:32和34。编码重链和轻链可变区的cdna的核苷酸序列(其包括信号序列)示于seqidno:31和33。(2)夹心elisa系统将c8maxinunc-immunobreakapartmodule(nunc)用作夹心elisa系统的孩史量培养板。用0.1m碳酸盐缓沖液(ph9.6)将抗-reg4单克隆抗体(克隆21-1)稀释到10昭/ml后，加入微量培养板(100^l/孔)，4°c静置过夜，以通过物理吸附来致敏抗体。封闭(室温2小时)后，弃封闭液，使剩余物干燥制得试验板。将来自患者的血清用已加入0.5吗/ml生物素化的抗-peg4多克隆抗体的样品稀释剂(pbs,0.1%tween20,1%bsa，ph7.3)稀释5倍。反应15分钟后，将血清加到试验板(100lil/孔)，反应2小时。洗涤5次后，加入8000倍稀释的hrp标记的链霉抗生物素蛋白(amersham;rpn4401)(100pl/孔)，反应1小时，然后洗涤5次。每孔加入100pltmb底物溶液(mossinc.;tmbultrasensitivesubstrate)显色。15分钟后，每孔加入100|il0.18m硫酸以终止显色反应，利用吸光度(a450/a620)测定获得自所述7例患者的术前和术后血清中reg4的浓度。进一步改良了上述夹心elisa系统，利用下述夹心elisa系统测定了59例胰腺癌症患者、35例炎症性胰腺疾病患者和56例健康受试者血清中reg4的浓度。c8—maxinunc-immunobreakapartmodule(nunc)用作微量培养板。用0.1m碳酸盐緩冲液(ph9.6)将抗-reg4单克隆抗体(克隆21-l)稀释到10jig/ml后，加入微量培养板(50ilil/孔)，4。c静置过夜，以通过物理吸附致敏抗体。用p/。bsa/pbs封闭(室温2小时)后，弃封闭液，使剩余物干燥制得试验板。将来自患者的血清用已加入0.5|ig/ml生物素化的抗-peg4多克隆抗体的样品稀释剂(pbs,0.1%tween20,1%bsa,ph7.3)牙希释5倍。反应15分钟后，将血清加到试验板(50(il/孔)，反应1小时。用洗涤緩冲液(0.13%tween20,0.15mnac1/10mmnah2p04)洗涤4次后，用反应緩冲液(同上述)将reg4特异的多克隆抗体调节至0.25pg/ml，每孔加50|il,室温反应l小时。用洗涤緩冲液洗涤4次后，加入用酶标抗体稀释剂(1%bsa,0.135mnac1/20mmhepes)稀释150,000倍的hrp标记的链霉抗生物素蛋白(amersham;rpn4401)(50^l/孔)，室温反应1小时，然后用洗涤緩冲液洗涤4次。每孔加入50tmb底物溶液(mossinc.;tmbultrasensitivesubstrate),室温静置30分钟显色。每孔加入500.36n硫酸终止显色反应，然后测量吸光度(a450/a620),利用校正曲线测定血清中reg4的浓度(图5)。(3)用elisa测量的血清reg4水平reg4是一种分泌性蛋白。本发明人利用其生产的抗体通过免疫沉淀证实了reg4蛋白分泌到胰腺癌症细胞系的培养基中(数据未显示)。为了测量胰腺癌症患者血清中reg4水平，本发明人利用对人reg4显示最强的亲和力的小鼠单克隆抗体(克隆21-1)和对人reg4的兔多克隆抗体建立了夹心elisa系统。夹心elisa的性能特征(标准曲线)显示于图2。此外，本发明人利用这些抗体建立了改良夹心elisa。改良夹心elisa的性能特征(标准曲线)显示于图5。为了确定reg4升高作为诊断标准(diagnostictest)的灵敏度，本发明人测量了123个健康人的血清reg4，界定了一个9.0ng/ml的截断值(cutoffva]ue)，即比在所述健康对照中的平均reg4水平高2倍sd的水平(图3)。随后本发明人分析了来自7例患有可手术的胰腺腺癌患者的术前和术后血清(图4)。所述7例中有4例显示术前reg4水平超过9.0ng/ml(病例2、3、4和5)，所述4例的reg4水平在其肿瘤被切除4周后下降到reg4水平的正常范围。这些结果提示血清reg4来源于胰腺癌症组织，且reg4是胰腺癌症的潜在血清学标志。其余病例显示术前和术后reg4都低于9.0ng/ml。此外，本发明人利用改良夹心elisa测量了59个胰腺癌症病例、35个其它胰腺疾病病例和56个正常健康人的血清reg4。胰腺癌症病例和正常健康人之间(p<0.01)以及胰腺癌症病例和其它胰腺疾病病例之间(p〈0.05)有显著性差异。为了确定reg4升高作为诊断标准的灵敏度，本发明人界定了一个3.78ng/ml的截断值，即比所述健康对照中的平均reg4水平高3倍sd的水平。结果，判定59个胰腺癌症病例中的29个(49.2%)、35个其它胰腺疾病病例中的10个(28.6。/。)和56个正常健康对照中的1个(1.8%)为阳性。另一方面，通过用于检测ca19-9(截断值25ng/ml)的elisa系统(ca19-9eiakit;canagdiagnosticsab)，判定了59个胰腺癌症病例中的45个(76.3%)、35个其它胰腺疾病病例中的13个(37.1%)和56个正常健康对照中的5个(8.9。/。)为阳性。59个胰腺癌症病例中的52个(88.1%)、35个其它胰腺疾病病例中的19个(54.3%)和56个正常健康人中的6个(10.7%)中，两种蛋白中至少一种是阳性的(图6)。本发明中，本发明人发现大约一半的pdac显示了reg斗蛋白的过表达，通过本发明人构建的elisa系统可以检测到一些pdac患者中血清reg4。在表2中，本发明人总结了其检查的7个病例中reg4、ca19-9和cea的临床病理学特征和术前血清水平，所述7个病例中的4例显示比正常健康对照更高的血清reg4水平(超过9.0ng/ml)。有趣地是，血清reg4在患有早期或非侵袭性胰腺癌症的患者(病例3和病例4)中处于高水平，在存活时间更长的患者(病例3、4和5)中也处于高水平，表明更有可能血清reg4可检测在pdac患者中哪些人预计有早期癌症或良好的预后。血清ca19-9和cea未发现这些早期或非侵袭性病例，血清reg4可能是筛查胰腺癌症的一种有希望的血清学标志。表2血清学标志物水平和临床病理学特征
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')正常范围<9.0ng/ml2)正常范围<36u/ml3)正常范围<5.0ng/ml,每种标志物在正常范围以上的值加下划线4)m:月血清reg4作为pdac肿瘤标志物的灵敏度和特异度应通过分析大量研究来确定。一些以前的研究报道了reg4在结肠直肠癌症(violettes，(2003)intjcancer.;103(2):185-93)、胃癌症(ouen,"a/.,(2005)cancerres.;64(7):2397-405)和炎性肠病(hartupeejc,"a/.，(2004)biochimbiophysacta.;1518(3):287-93)中的表达，需要进一步的研究来检验是否血清reg4可以将胰腺癌症与这些疾病区分开。此外，慢性胰腺炎是本发明人欲与pdac的区别良性疾病之一。考虑到reg家族可能与组织再生有关，本发明人还需要分析来自于慢性胰腺炎患者的血清。然而，胰腺癌症，特别是早期pdac，非常难于检测，而其它可能与高水平血清reg斗相关的肠或胃的病变用内镜检查很容易检测，即使血清reg4在这些消化道疾病中升高，仍然认为血清reg4测量对筛查胰腺癌有价值。像其它肿瘤标志物一样，血清reg4可能没有足够能力检测所有pdac病例或将pdac区别于其它疾病，但是将血清reg4与其它肿瘤标志物(例如ca19-9)或诊断性影像学结合，则可能为我们提供有望检测pdac的早期或前期病变并更有效地筛查这些疾病的方法。工业实用性本发明涉及reg4水平在胰腺癌症患者的血清中与正常对照相比有所升高这一发现。因此，reg4蛋白作为诊断标志物(即血清)有实用性。本发明利用reg4水平作为指标，提供诊断癌症患者和监测癌症治疗进展的方法。现有技术未能提供用于胰腺癌症的合适的血清学标志物。本发明的新型血清学标志物reg4可以提高检测胰腺癌症的灵敏度。此外，reg4和ca19-9的结合有助于提高检测胰腺癌症的灵敏度。尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但很明显本领域技术人员可对本发明进行各种变化和修改而不背离本发明的精神和范围。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属
技术领域：
中的普通技术人员所常规理解的意思相同。尽管在实施或检验本发明时可使用与本文所述类似或等同的方法和材料，但适当的方法和材料如本说明书下面的描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都全文并入本文作为参考。在存在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，本文描述的材料、方法和实施例仅是为了说明而非限制本发明。已经参考具体实施例和优选实施方案说明了本发明。应该理解的是，本发明并不意欲受到上述说明的限定，而由附加的权利要求及其等同物限定。权利要求1.一种诊断受试者中胰腺癌症的方法，包括如下步骤(a)提供来自于待诊断的受试者的血液样品；(b)测定所述血液样品中的reg4水平；(c)将步骤(b)中测定的reg4水平与正常对照的reg4水平相比较，其中与正常对照相比，所述血液样品中的高reg4水平表示该受试者患有胰腺癌症。2.权利要求1的方法，其中所述血液样品选自下组全血、血清和血浆。3.权利要求1的方法，其中所述reg4水平通过4企测血液样品中的reg4蛋白来测定。4.权利要求3的方法，其中利用免疫测定检测所述reg4蛋白。5.权利要求4的方法，其中所述免疫测定是elisa。6.权利要求4的方法，其中所述免疫测定是夹心法，其利用固定化在载体上的抗-reg4单克隆抗体。7.权利要求6的方法，其中所述单克隆抗体含有vh链和vl链，每条vh链和vl链包含被框架氨基酸序列隔开的cdr氨基酸序列，称作cdr1、cdr2和cdr3,每条vh链和vl链中各cdr的氨基酸序列选自下组vhcdrl:seqidno:18vhcdr2:seqidno:20vhcdr3:seqidno:22vlcdrl:seqidno:26vlcdr2:seqidno:28和vlcdr3:seqidno:30,或者包含其抗原结合区的片段。8.权利要求7的方法，其中所述vh包含seqidno:16的氨基酸序列，vl包含seqidno:24的氨基酸序列。9.权利要求1的方法，进一步包括如下步骤(e)测定血液样品中的ca19-9水平；(f)将步骤(e)中测定的ca19-9水平与正常对照的cai9-9水平相比较，其中与正常对照相比，血液样品中的高reg4水平和/或高ca19-9水平表示该受试者患有胰腺癌症。10.—种用于检测血液样品中reg4的免疫测定试剂，该试剂包括抗-reg4抗体。11.权利要求10的试剂，其中所述单克隆抗体固定化在载体上。12.权利要求11的试剂，其中抗-reg4抗体包括含有vh链和vl链的单克隆抗体，每条vh链和vl链包含被框架氨基酸序列隔开的cdr氨基酸序列，称作cdr1、cdr2和cdr3，每条vh链和vl链中各cdr的氨基酸序列选自下组vhcdr1:segidno:18vhcdr2:seqidno:20vhcdr3:seqidno:22vlcdr1:seqidno:26vlcdr2:seqidno:28和vlcdr3:seqidno:30，或者包含其抗原结合区的片段。13.权利要求12的试剂，其中所述vh包含seqidno:16的氨基酸序列，vl包含seqidno:24的氨基酸序列。14.一种用于检测胰腺癌症的试剂盒，该试剂盒包括(i)用于;f佥测血液样品中reg4水平的免疫测定试剂；和(ii)reg4的阳性对照样品。15.权利要求14的试剂盒，其进一步包括(iii)用于检测血液样品中ca19-9水平的免疫测定试剂；和(iv)ca19-9的阳性对照样品。16.权利要求15的试剂盒，其中所述阳性对照样品对reg4和ca19-9都呈阳性。17.权利要求16的试剂盒，其中所述阳性对照样品为液体形式。18.—种用于检测胰腺癌症的阳性对照血液样品，该血液样品包含超过正常水平的reg4和ca19-9。19一种含有vh链和vl链的抗-reg4单克隆抗体，其中每条vh链和vl链包含被框架氨基酸序列隔开的cdr氨基酸序列，称作cdr1、cdr2和cdr3，每条vh链和vl链中各cdr的氨基酸序列选自下组vhcdr1:seqidno:18vhcdr2:seqidno:20vhcdr3:seqidno:22vlcdr1:seqidno:26vlcdr2:seqidno:28和vlcdr3:seqidno:30,或者包含其抗原结合区的片段。20.权利要求19的单克隆抗体，其中所述vh包含seqidno:16的氨基酸序列，所述vl包含seqidno:24的氨基酸序列。全文摘要reg4——reg家族的一个新成员，被鉴定为胰腺腺癌的生物标志物。本发明提供夹心elisa以检测患有可切除的胰腺癌症(即pdac)患者中血清reg4。本发明还提供一种利用reg4作为血清学标志诊断胰腺癌的方法。文档编号c07k16/18gk101438167sq20078001592公开日2009年5月20日申请日期2007年2月28日优先权日2006年3月2日发明者中川英刀,中村佑辅,中鹤修一申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司