专利名称：：肽及蛋白质的修饰的制作方法产业上的利用领域本发明涉及生物活性肽或生物活性蛋白质的修饰方法及其修饰物质。
背景技术：
：已知有大量的生物活性肽或生物活性蛋白质，以下将这些进行归纳，也可统称为生物活性肽。这些生物活性肽，可以举出如白细胞介素(il)-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、g-csf、gm-csf、m-csf、促红细胞生长素(erythropoietin)、干细胞生长因子(干细胞因子、stemcellfactor)、mpl-配体(mpl-ligand)、α-、β-、γ-干扰素、促生长素抑制素、加压素(vasopressin)、胰岛素(iinsulin)、生长激素(growthhormone)、物质p(substancep)、adf(atlderivedfactor、人硫氧还蛋白)等、人体中起生理作用的肽及变型的这些的肽、来自蚕素类动物的物质、来自天冬酰氨酶(asparaginase)类微生物的物质、来自细胞溶素类植物的物质，另外抗体中也包括在这些的生物活性肽中。作为这些抗体不仅是人的单克隆抗体，也包括动物的单克隆抗体。这些中的某些物质已经被利用于医药和诊断中，另外还有一些物质正在研究利用于医药或诊断药中。例如，il-2用于抗癌剂，促红细胞生长素、g-csf作为造血剂使用，胰岛素和生长激素临床应用于先天的、后天的这些缺损或不足的患者治疗。进而，il-6作为血小板增强剂正在临床应用开发中。这些生物活性肽作为医药是很重要的，但是为了进而对生物活性肽赋予新的机能，或者弥补生物活性肽作为医药上缺点的目的，目前正在研究用高分子物质等修饰生物活性肽。例如，作为先天性免疫疾病的腺苷脱氨酶缺损症，是由于正常的腺苷脱氨酶缺损(ada)而引起的，为了延长ada在体内的的停留时间，将用聚乙二醇(peg)修饰过的ada作为医药使用。另一方面，大多的生物活性肽必需特异地结合在对应的受体或配位体上才能发挥其生理功能，所以利用这种的特异结合，考虑将特定的生物活性肽作为靶分子使用。例如，在il-6分子上，结合白喉毒素，将该毒素特异地送入具有il-6受体的癌细胞内，试验着杀死癌细胞。正在开发着在识别癌特异的抗原的单克隆抗体中结合制癌剂，将制癌剂特异地送入癌细胞内产生同样效果的方法。进而，在药物传送系统(dds)中，利用生物活性肽的试验方法在基因治疗领域也很重要。特别是供给到基因的生物体内(invivo)的基因治疗具有很大的期待，georgey.wu等用化学的方法，开发了在血清类粘蛋白(orsomucoid)等的生物活性肽结合聚赖氨酸(具有正电荷)，用此复合体包含dna质粒(负电荷)以将dna运送到具有血清类粘蛋白抗体的肝细胞中的基因治疗法(j.biol.chem.，263，14621，1988)。这些生物活性肽在临床上存在着以下的问题。1.副作用本来认为将这些在生物体内起着生理作用的、生物活性肽投入人体后是没有什么副作用的，可是在临床上使用时，几乎大多的生物活性肽都显示了一些副作用。这是由于这些生物活性肽本来是在局部产生、放出、并在局部作用的，当时大部分都被分解掉，与其相反，而在临床上给予的生物活性肽可以在短时间内以很高的血中浓度分布到全身，所以，一般会产生非生理的反应和临床上不希望的反应。2.很快的代谢速度对于大多的生物活性肽，是不适宜在生物体内长时间存在的，在血中被分解，或被一些器官捕集后而分解，所以以很快的速度从血中消失。这样生物活性肽的药效就难以发挥。3.抗原性人体内的生物活性肽抗原性低，但对于重组体制作的生物活性肽，在临床上是使用没有糖链物质和带有与天然不同糖链物质。根据情况，这些具有抗原性，但在长时间或多次给药时，会形成抗体，中和给予的生物活性肽，产生药效消失，最坏时会在人体内引起过敏性反应。为了解决这些生物活性肽所存在的上述问题，采取了以下的方法。1.将对于脏器或组织，具有特异亲和性的分子，例如对骨髓细胞中大多分布的c-kit分子特异结合的干细胞生长因子(干细胞因子(scf))与il-6分子结合的分子，il-6/scf在骨髓中浓缩，il-6的作用是促进巨核细胞向血小板的分化，可以增加血小板。il-6是作用在视床下部，通过视神经引起发热，但是由于将il-6向骨髓的浓缩，所以可减少发热副作用。同样，为了使il-2作用在肿瘤特异的细胞毒素t细胞(cytotoxictcell(ctl))，可以考虑在il-2分子上结合肿瘤抗原分子、肿瘤自体或肿瘤细胞破碎组分的形式给药。识别肿瘤抗原的ctl结合在该肿瘤抗原上，进而，结合在上面的il-2有效地被活化，可以攻击肿瘤细胞。用于病毒性肝炎的干扰素(α-、β-、γ-干扰素)与对asialoglycoprotein等的肝asialoglycoprotein受体的配位体结合，以肝脏为靶，期待着可以减轻ifn的副作用。另外，作用在造血系的前体细胞，将其分化增殖或者作用在造血系癌后，增强免疫性或抗癌剂作用的目的而使用的tnf、g-csf、gm-csf、il-11、scf、mpl-ligand、lif、il-3等，由于使用分别和其对应的作用细胞或相邻支持细胞上具有结合能的分子(靶分子)的结合体，所以期待可以减少各个的副作用。对于用在造血系以外的癌治疗的tnf、ifn也有同样的效果。2.给予的il-6迅速地从血液中消失，但是若将il-6与人体血清白蛋白(humanserumalbumin(hsa))、聚赖氨酸、peg类的生物体网状内皮系统(reticuloendothelialsystem，res)难以捕集的高分子物质结合时，可以延长il-6在血液中的半衰期。另外，adf(atlderivedfactor、人硫氧还蛋白；mitsui.etal.，(1992)biophys.biochem.res.com.186(3)，1220-1226.)或sod(superoxidedismutase)是还原初生态氧的生物体内分子，作为抗炎剂正在临床试用，但是如果长时间地维持adf或sod中的血中浓度时，可以期待更高的抗炎效果。与il-6相同地通过在adf或sod上结合hsa和peg可以增加adf或sod的抗炎效果。对于il-2、ifn、g-csf、gm-csf、il-11、scf、mpl-ligand、lif、il-3、tnf等同样地可以期待提高效果。3.已知由于先天地缺损某些酶而引起的基因病有很多种。例如，缺损嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)时，会引起神经障碍，导致死亡，但是若将牛的pnp结合在聚乙二醇(polyethyleneglicol(peg))上的物质进行给药时，可以在一定的程度上进行补救。结合了peg，可以降低牛的抗原性，并能应用在临床上。这可以解释为构成pnp的抗原部位用peg屏蔽的结果。将hsa结合在pnp上同样可以期待减少抗原性。对于用在抗血栓症的蛇毒肽等，通过结合hsa和peg也可以得到同样的减少抗原性效果。这样，无论在弥补生物活性肽缺点的修饰的场合，或是将生物活性肽作为标的分子使用场合，将生物活性肽和其它的生物活性肽、糖链、peg等在不失去相互功能地结合、修饰是很重要的。一般，用于进行这样修饰的结合是采用化学的方法。化学反应时，控制生成的化学结合位置和结合数是困难的，要想在保持结合对象两者活性条件下得到结合体是困难的。另外，生产具有一定结构的结合物的药品是极其重要的，但是难以控制。特别是高分子间的结合时，同时会生成多个形式的结合物，精制单一物是极其困难的。发明的公开本发明涉及生物活性肽或生物活性蛋白质的修饰方法，其特征在于将至少具有谷氨酰胺残基的生物活性肽或生物活性蛋白质和具有氨基供体的物质，在来自微生物转谷氨酰胺酶的存在下进行反应，在该谷氨酰胺残基的γ-位酰胺上形成该氨基供体的氨基和酰胺键。另外，本发明涉及用生物活性肽或生物活性蛋白质的修饰方法，制造出的肽或蛋白质的修饰体，其特征在于将至少具有谷氨酰胺残基的生物活性肽或生物活性蛋白质和氨基供体的物质，在来自微生物转谷氨酰胺酶的存在下进行反应，在该谷氨酰胺残基的γ-位酰胺上形成该氨基供体的氨基和酰胺键。本发明人等为了解决上述问题，不断地进行了研究，其结果发现了将具有生物活性肽或生物活性蛋白质和氨基供体(氨基)的物质通过使用转谷氨酰胺酶，在缓和的条件下可以选择地进行结合的事实。转谷氨酰胺酶(ec2.3.2.13)(系统名protein-glutaminer-glutamyltransferase)是可以使肽或蛋白质中的谷氨酰胺残基和具有氨基物质的氨基进行特异结合的公知酶。关于转谷氨酰胺酶，已有各种文献报道过，作为一部分例子举例如下。(1)j.e.folketal.adv.proteinchem.31，1-133，1977(2)j.e.folketal.adv.enzymol，38，109-191，1973(3)h.bohnetal，mol.cellbiochem.20，67-75，1978(4)l.lorandetal，handbookofbiochemistryandmolecularbiology，vol.2，proteins，edg.d.fasman，pp.669-685，clevelandcrc，3rded.(5)guineapigandrabbitlivertransglutaminaset.abeetal，biochemistry，16，5495-5501(1977)(6)humanredbloodcellstranglutaminases.c.brenneretal，biochim，biophys，acta，522，74-83，1978(7)ratcoagulatingglandtransglutaminasej.wilsonetalfed.proc.，38，1809(abstr.)，(1979)另外，已经知道转谷氨酰胺酶根据其来源有各种各样，例如来自微生物的转谷氨酰胺酶(bacterialtransglutaminase、以下称为btg。在h.andoet，al，agric.biol.chem.，53(10)，2613-2617(1989)，k，wshizuetal，biosci.biotech.biochem.，58(1).82-87(1994)等中有报道。)、肝转谷氨酰胺酶(livertransglutaminase)、血浆因子xiii(aplasmafactorxiiia)、血小板-胎盘因子xiiia(plateletandplacentalfactorxiiia)、毛发滤胞转谷氨酰胺酶(hair-follicletransglutaminase)、上皮转谷氨酰胺酶(epidemaltransglutaminase)、前列腺转谷氨酰胺酶(prostatetransglutaminase)等来自动物的转谷氨酰胺酶(mammalliantransglutaminase)等。作为本发明使用的转谷氨酰胺酶，可以使用上述的一种，但是优选的是使用btg。用转谷氨酰胺酶结合时由于可使反应限制在特定的位置，所以副生物的种类少，也易于控制。另外由于是酶反应，相对于化学反应具有下列的优点。1)不失掉结合对象的功能下，在特定位置作成结合物的可能性高。2)由于结合反应条件是生化的条件，所以不会使结合对象物改性。3)由于保持了稳定的质量，所以可以制造高质量的药品。另外，使蛋白质和蛋白质结合的方法有使各基因结合的重组dna的技术。相对于重组dna方法，使用转谷氨酰胺酶的方法有以下的优点。1)与重组dna方法比较，对从dna不能直接合成的物质，例如糖链、糖蛋白、糖脂质、peg等也可以结合。2)在重组dna方法中，只能制作在一方蛋白质的n末端或c末端结合另一方蛋白质的融合蛋白质。3)在重组dna方法中，只能得到在n末端或c末端结合另一方蛋白质的融合蛋白质，所以活性中心若存在于蛋白质的末端时，此融合蛋白质失去活性的可能性大。另一方面，使用转谷氨酰胺酶时，是限定在谷氨酰胺的酰胺基，可以结合具有氨基的物质，能得到与重组dna方法不同的结合体。通过btg的结合控制，可以得到保持两者活性的结合体。本发明的生物活性肽或生物活性蛋白质和具有氨基供体物质的结合，在使用转谷氨酰胺酶的反应条件下进行反应。例如，使用btg时，可以在温度4-55℃，优选的是30-50℃，ph5-8，优选的是ph6-7.5条件下进行反应。转谷氨酰胺酶活性的测定方法本发明所说的转谷氨酰胺酶的活性单位用以下的方法测定。即在温度37℃、ph6.0的tris缓冲液中，使用来自动物的酶时在5mm的ca2 存在下，来自微生物时，没有ca2 存在的条件下，以苄氧羰基-l-谷氨酰胺甘氨酸及羟基胺为基质的反应系中，使转谷氨酰胺酶作用，生成的羟肟酸在三氯醋酸存在下形成铁络合物后，测定525nm的吸光度，用检量线求出羟肟酸量，在1分钟内生成1μ摩尔的羟肟酸的酶作为转谷氨酰胺酶的活性单位，1单位(iu)。作为修饰本发明的生物活性肽的氨基供体的物质，只要在分子中有氨基即可，其它没有特殊的限制，但是优选的是使用具有氨基的肽和蛋白质，这些物质有上述的生物活性肽或蛋白质、抗体、特别是单克隆抗体、抗原、多氨基酸、聚乙二醇的烷基胺衍生物、特别优选的是聚赖氨酸或聚乙二醇的烷基胺衍生物。这些的分子量是3000-200000，优选的是3000-100000。进而还可以举出分子量为5000-200000，优选的是10000-100000的。另外，作为本发明的生物活性肽，只要在氨基酸序列中含有谷氨酰胺即可，其它没有特殊的限制，优选的是上述的生物活性肽或蛋白质，更优选的是白细胞介素-2、白细胞介素-6、干扰素、adf(atlderivedfacta，人硫氧还蛋白)等。用本发明的方法得到的生物活性肽或蛋白质的修饰体例如下。1)il-2作用在担负免疫细胞上后，增强免疫力，具有可杀灭癌细胞的可能性，但是投入到全身时，副作用很强，所以使其集聚到作用部位即t细胞和nk/lak细胞或者癌细胞周围是重要的。il-2/抗cd8抗体〔向cd8阳性t细胞集聚〕il-2/抗cd4抗体〔向cd4阳性t细胞集聚〕il-2/抗nk/lak细胞抗体〔向nk/lak细胞集聚〕il-2/对于肝细胞特异抗原的抗体)(例如，抗硫酸脂抗体、抗白蛋白受体抗体)〔向肝赃集聚后，增加肝脏周围的免疫力〕il-2/聚合hsa〔聚合hsa结合在肝脏的白蛋白的受体抗体上，集聚在肝癌上〕il-2/抗erbb2抗体或erbb2配位体〔向具有erbb2的癌集聚〕il-2/对大肠特异的癌抗原的抗体〔向大肠癌集聚〕il-2/对黑素瘤特异的抗原的抗体〔向黑素瘤集聚〕il-2/聚赖氨酸〔延长血中半衰期〕il-2/peg(聚乙二醇)〔延长血中半衰期〕il-2/hsa(humanserumalbumin)〔延长血中半衰期〕il-2二聚物〔延长血中半衰期〕il-2/蘑菇多糖〔增加相乘的抗癌作用〕il-2/il-9〔相乘的t细胞活性化〕il-2/il-12〔相乘的t细胞活性化〕il-2/毒素(例如，破伤风毒素(tetanustoxin)、假单胞菌毒素(pscudomonastoxin))〔除去具有il-2受体的癌细胞〕2)il-6作用在血小板的前体细胞后，具有增加血小板数的作用，但是作用在肝脏上后，放出急性期蛋白质，或作用在中枢神经系统引起发热，所以作为血小板增加剂使用时，使其向骨髓集聚是非常重要的。il-6在血中的浓度达到某种程度以上时，会产生副作用，但是若延长血中的半衰期，可以暂时地避免高浓度的给药，所以延长血中的半衰期给予缓释效果，可以产生减轻副作用的效果。il-6/对骨髓细胞或骨髓细胞的支持细胞(基质细胞等)的抗体〔向骨髓细胞集聚〕il-6/对在骨髓细胞大多能表达的受体的配位体(例如，scf、il-11、mpl-配位体、g-csf、gm-csf或il-3〔向骨髓细胞集聚及il-6和scf或mpl-配位体的血小板的增加作用或对造血干细胞增加作用的相乘作用)il-6/对骨髓细胞特异细胞外基质的配位体或具有特异亲和力的分子〔向骨髓细胞集聚〕il-6/聚赖氨酸〔延长血中半衰期〕il-6/peg〔延长血中半衰期〕il-6/hsa〔延长血中半衰期〕il-6二聚物〔延长血中半衰期〕il-2/毒素(例如，破伤风毒素(tetanustoxin)、假单胞菌毒素(pscudomonastoxin))〔除去具有il-6受体的癌细胞，例如骨髓瘤〕3)进而，il-6涉及慢性风湿病、卡斯尔病等的自身免疫疾病，由于il-6和il-6受体异常表达引起白细胞癌细胞的异常增殖、某种的癌细胞的恶液质原因、细菌感染时诱发的休克等，根据情况成为疾病的原因或增恶因子。因此通过抗il-6抗体或抗il-6受体的抗体消除il-6作用物质成为上述疾病的治疗药。考虑将抗il-6抗体用于治疗慢性关节风湿病时，抗il-6抗体是小鼠单克隆抗体，可以直接使用，或者使用其可变部(variableregion)与人的抗体恒定部(constantregion)融合的嵌合体抗体和l链可变部(lightchainvariableregion)和h链可变部(heavychainvariableregion)的融合蛋白构成的1根链抗体等，将其投入关节腔。总之，对于人作成了对此抗体的抗体，这样就存在消除抗il-6抗体作用的危险。另外一根链抗体形式的人工抗体有可能缩短血中或关节腔中的半衰期。因此，降低抗il-6抗体的抗原性和延长血中或关节腔中的半衰期等是有效的。具有一个特异性的抗体和另一个具有特异性的抗体结合而成的二官能性抗体(bfabifunctionalantibody)可能具有新的医药功能，例如，在抗il-6抗体上结合抗il-1抗体的bfa可以同时抑制作为慢性关节风湿病的增恶因子的il-1和il-6，发挥了相乘的效果。以下举出这些例子。抗il-6抗体/hsa〔延长血中或关节腔中半衰期、减少抗原性〕抗il-6抗体/聚赖氨酸〔延长血中或关节腔中半衰期、减少抗原性〕抗il-6抗体/胶原〔延长血中或关节腔中半衰期、减少抗原性〕抗il-6抗体/抗il-1抗体〔增强慢性关节风湿病的效果〕4)聚赖氨酸是带有正电荷的聚合物，在水溶液中包复具有负电荷的dna分子，对其进行保护，在聚赖氨酸上结合靶分子。通过结合物和dna分子混合形成用靶分子包复dna的复合体。此复合体通过投入到活体内将基因导入到与靶分子对应的组织内，可以表达蛋白质。包复dna的分子不一定限定在聚赖氨酸，只要是具有与dna有一些亲和性的物质，对活体无害，并且在循环器官系统的部位难以捕集的物质都可以。5)inf-α-、β-、γ具有抗病毒的作用，可用于治疗病毒性肝炎。可是，由于大量的、长期的给药使副作用加剧，因此，通过对作用部位，即将肝脏作成靶，来减少ifn的副作用。此时，通过对存在于肝脏实质细胞表面的asialoglico蛋白质配位体的结合，可以发挥向肝脏的靶作用。另一方面，在血中，由于可以暂时抑制高浓度，所以能延长血中的半衰期，给予缓释效果时，能减少副作用。inf/asia血清类粘蛋白〔向肝脏集聚〕inf/ァシァロフェッィン〔向肝脏集聚〕inf/半乳糖修饰白蛋白〔向肝脏集聚〕inf/半乳糖修饰聚赖氨酸〔向肝脏集聚〕inf/支链型半乳糖修饰合成配位体〔向肝脏集聚〕inf/peg〔延长血中半衰期〕inf/hsa〔延长血中半衰期〕inf二聚物〔延长血中半衰期〕6)adf(atlderivedfactor)由于可以还原初生态氧，作为消炎剂正在临床上试验，但是在血中的停留性低。因此，通过延长血中的半衰期可以增加消炎效果。另外adf可以期待治疗肝组织障碍的线粒体的功能不全，所以通过以肝脏作为靶能增加其效果。adf/peg〔延长血中半衰期〕adf/聚赖氨酸〔延长血中半衰期〕adf/hsa〔延长血中半衰期〕adf二聚物〔延长血中半衰期〕adf/asia血清类粘蛋白〔向肝脏集聚〕adf/ァシァロフェッィン〔向肝脏集聚〕adf/半乳糖修饰白蛋白〔向肝脏集聚〕adf/半乳糖修饰聚赖氨酸〔向肝脏集聚〕adf/支链型半乳糖修饰合成配位体〔向肝脏集聚〕按照本发明，通过使用来自微生物的转谷氨酰胺酶(btg)，在具有谷氨酰胺生物活性肽或蛋白质的谷氨酰胺残基部分，在特异的且是缓和的条件下，可以修饰该肽或蛋白质。在不消失生物活性肽或蛋白质特性下改善该肽或蛋白质的性质。按照本发明，将具有谷氨酰胺的生物活性肽或蛋白质和具有氨基的肽或蛋白质在缓和条件下特异地融和，所以可以得到具有两方性质的有用蛋白质。例如，通过使用抗体，特别是单克隆抗体进行修饰，可以将该生物活性肽或蛋白质特异地集聚在必要的组织、脏器、细胞等中。附图的简单说明图1表示il-6及il-2的btg处理物的sds-page图。图2表示精制结合聚赖氨酸的il-6的色谱图。图3表示结合聚赖氨酸的rhil-6的sds-page图。图4表示结合peg的rhil-6的sds-page图。图5表示结合单克隆抗体的rhil-6的维斯坦布勒特法的结果图。图6表示结合聚乙二醇(peg)的rhil-2的sds-page图。图7表示结合聚乙二醇(peg)的rhil-6的sds-page图。图8表示结合聚乙二醇(peg)的rinf-α-2b的sds-page图。图9表示结合聚乙二醇(peg)的radf的sds-page图。实施发明的方案以下根据实施例具体的说明本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。实施例1构成btg基质的各种生物活性蛋白质的检索。作为对象生物活性蛋白质，使用重组物(リコンビナントヒト)(rh)il-2、rhil-6及hsa。rhil-2，1mg/ml70mm醋酸钠、ph5.0、250mmnaclrhil-6，1.75mg/ml10mm柠檬酸钠、ph6.0、has，pasteurmerieux制(出售地富士レヒ才)、200mg/ml方法1)在含有各蛋白质0.5-2mg的1ml溶液中，加入等量的50μm一丹酰戊二胺(monodansylcadaverine)溶液(ph7.5、50mmtris-hcl)。添加必要最小量的0.1n-naoh后，将各溶液的ph调节到7.2-7.4。2)向配制的各反应液250μl中添加精制的btg溶液(10unit/ml)10μl，在37℃下静置培养2小时后，添加1m的硫酸铵20μl，结束反应。作为对照，在添加酶液前是准备了添加硫酸铵的溶液。3)将200μl的各反应液作为样品散布在nunc社的96微孔板上，加在密力巴社(ミリポァ社)制的荧光板读取器(cytoflufuor)测定光强度。滤波器中，激发(excitation)选择360/40nm、发射(emission)选择530/25nm，灵敏度选择6。结果，如表1所示。表1蛋白质萤光强度对照btg处理btg的反应性rhil-2523597 rhil-65502,267 hsa695940 实施例2使用btg的rhil-2、rhil-6的交联聚合反应。试剂rhil-2、rhil-6溶液使用与实施例1相同的物质。方法1)向rhil-2或rhil-6溶液100μl中添加实施例1使用的酶液10μl，在37℃下放置90分钟。作为对照是添加同量的蒸馏水来代替酶液。反应结束后，立即加入100μl的sds-page用试样调节液，配制sds-page的试样。2)试样的sds-page是使用法斯特系统(phastsystem)进行的。凝胶是用法斯特凝胶110-15，染色是使用银染色的法斯特银染剂盒(phastsilversteinkit)进行的。取样的试剂量是1μl。图1表示了结果的sds-page图形。图1中的1表示标记、2表示rhil-6、3表示btg处理的rhil-6、4表示rhil-2、5表示btg处理的rhil-2。在btg处理的3及5中，显示着更高分子量的斑点，表示rhil-2及rhil-6用btg处理而产生的交联聚合化的事实。实施例3结合聚赖氨酸的rhil-6制备将10mg的聚赖氨酸溴酸盐(分子量7900、45700、83800sigma社制)溶解在1ml的50mmtris-hcl(ph7.5)。向其中添加50μl的btg溶液(14u/ml50mmtris-hclph7.5)。在室温下培养30分钟。向其中加入2ml的rhil-6溶液(2mg/ml10mm柠檬酸钠、ph6.0)搅拌后，在37℃下放置2.5小时(分子量7900时)或20小时(分子量45700或83800时)，用逆相hplc精制反应液。洗脱条件与图2所示的条件相同。收集聚赖氨酸结合rhil-6流分，用逆相hplc浓缩。条件与图2相同，但是b0％→b100％，5分钟。收集聚赖氨酸结合rhil-6流分，用凝聚过滤，脱去溶剂。条件柱sephadexg-25(1×10cm)缓冲液20mmtris-hcl、0.5mnacl、ph8.5流速2ml/min在图2中表示了用逆相hplc分析精制后的结合聚赖氨酸的rhil-6的纯度的结果。如图2所示，大约精制成单一的物质。图2的1表示rhil-6(保留时间14.12分钟)、图2的2表示分子量7900的结合了聚赖氨酸的rhil-6(保留时间12.38分钟)、图2的3表示分子量45700的结合了聚赖氨酸的rhil-6(保留时间12.16分钟)、图2的4表示分子量83800的结合了聚赖氨酸的rhil-6(保留时间11.46分钟)。该hplc的条件，柱vydacproteinc4214tp54(4.6×250mm)。溶剂a是0.1％三氟醋酸(tfa)b是0.1％tfa-80％乙腈。洗脱顺序从b40％20分钟→b100％。流速1ml/分钟。在图3中表示了结合了聚赖氨酸的rhil-6(分子量7900时)的sds-page。如图3所示，结合聚赖氨酸的rhil-6大约是单一的带。图3中1表示标记，2表示rhil-6，3表示结合了聚赖氨酸的rhil-6(分子量7900时)。实施例4结合了聚乙二醇(peg)的rhil-6的制备将10mg的聚氧乙烯双(6-氨基己基)(分子量3350sigma社制)溶解在1ml的50mmtris-hcl(ph7.5)。向其中添加50μl的btg溶液(14u/ml50mmtris-hclph7.5)。在室温下放置30分钟。向其中加入2ml的rhil-6溶液(2mg/ml10mm柠檬酸钠、ph6.0)搅拌后，在37℃下放置2.5小时，用逆相hplc精制反应液。精制条件与实施例3相同(图2)。收集结合聚赖氨酸的rhil-6流分，用逆相hplc浓缩。条件与实施例3相同，但是洗脱顺序是b0％→b100％，5分钟。收集结合peg的rhil-6流分，用凝聚过滤，脱去溶剂。条件柱sephadexg-25(1×10cm)缓冲液20mmtris-hcl、0.5mnacl、ph8.5流速2ml/min用sds-page解析精制物(图4)。结合peg的rhil-6在分子量大约24000的位置显示单一的带。可认为相对于未修饰体结合了一个分子的peg。图4中，1表示rhil-6、2表示精制的结合peg的rhil-6。结合peg的rhil-6大约是单一的带。实施例51)结合聚赖氨酸的rhil-6及结合peg的rhil-6的体外活性。方法使用的细胞系为亚克隆il-6依赖的鼠杂交细胞瘤mh60bsf2所得到的mh60.32株。在96孔培养板的每一孔都加入以下的溶液。a)在培养基中逐步稀释的100μl样品溶液(从100mg/ml稀释3倍)b)在培养基中洗涤三次并悬浮于100μl培养基中的5×103mh60。在37℃，50％co2存在下培养60小时后，使用mtt测定法测定细胞数目，mtt法按以下进行。在每孔中加入50μlmtt溶液(3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯基四唑溴1mg/mlpbs溶液)，放置大约6小时后，移出150ml上清液，在残留物中加入100μlmtt溶液(20％sds0.04nhcl溶液，放置一夜。通过微量培养板读数器测定光吸收值(从570-620mm)。本实验所使用的培养基是prpmi1640(gibco社)、10％vcs(灭活的)。单位是按照平野等(proc.n.a.s.，82，5490(1985)的方法计算的。结果如表2所示，在mh60的增殖活性中，结合聚赖氨酸的rhil-6(实施例3制备的三种结合聚赖氨酸的rhil-6)及结合peg的rhil-6显示了与rhil-6大约相同的活性。结合聚赖氨酸的rhil-6及结合peg的rhil-6的体外活性结合聚赖氨酸的rhil-6及结合peg的rhil-6的内活性(血小板数增加)表3实施例6rhil-6与单克隆抗体的结合在小鼠单克隆抗体白鼠巨核细胞/血小板抗体50μg/50μl、50mmtris-hclph7.5中，加入btg1u/100μl、50mmtris-hclph7.5，在室温下放置30分钟后，加入rhil-650μg/25μl、10mm柠檬酸钠ph7.0，在20℃下反应4小时。将反应液供给到预先用10mm醋酸钠缓冲液ph7.0平衡的小鼠单克隆抗rhil-6抗体柱中，接着用0.1nhcl、2mnacl洗脱。再用0.3mtris-hcl，ph8.5稀释三倍后，供给到预先用10mm醋酸钠缓冲液ph7.0平衡的蛋白g柱中(pharmacia社制)，接着用0.1m赖氨酸-hcl缓冲液ph2.7洗脱，将洗脱级分加在sds-page上，用抗rhil-6抗体进行嵌合(ゥェスタンブロッテング)。其结果表示在图4中。在抗rhil-6抗体柱和蛋白g柱上吸附的物质均可在高分子区域检测出，这表示单克隆抗体与rhil-6的结合。图4中，1表示标记、2表示反应液、3表示抗rhil-6抗体、4表示抗rhil-6抗体柱吸附级分、5表示蛋白g柱吸附级分。此外，3表示了超过抗体柱容量后，rhil-6结合物溢流的事实。实施例7结合聚乙二醇(peg)的rhil-2的制备将溶解在含有0.25m的nacl50mm醋酸缓冲液(ph5.0)的rhil-2溶液(2.5ml)加在预先用200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5)平衡的柱中(sephadexg-25)，用上述缓冲液进行洗脱。洗脱液用280nm的吸光度监测，得到rhil-2的洗脱级分(3ml)。将此洗脱级分的蛋白质浓度，以1.2×104m-1cm-1计换算成280下的摩尔吸光系数，进而用上述tris缓冲液的稀释，配制5μl的蛋白质溶液。在此稀释溶液中(2.5ml)添加75mg的聚氧乙烯双(6-氨基己基)(分子量3350、sigma社制)，37℃下培养。向此反应液中添加250μl的btg溶液(220u/ml200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5))，37℃下培养2小时。使用“ymcc8ap”柱(山村化学社制)的反相hplc精制反应液。除去未反应的rhil-2级分。使用phastsystem(pharmacia社制)的sds-page(monogenious20凝胶)分析精制物的纯度。其结果，用peg的修饰体(peg-rhil-2)比未修饰体，结合了1个分子的peg并且只是在其予想程度上升的位置上，确认了来自蛋白质的带(图6)。图6中1表示分子量标记、2表示rhil-2、3表示结合peg的rhil-2。实施例8结合聚乙二醇(peg)的rhil-2(peg-rhil-2)的活性将il-2依赖性小鼠细胞“ctll-2”在含有ratil-2(collaborative社制)约50units/ml10％fcs(牛胎血清)的rpmi1640培养基中培养。本细胞用含有10％fcs的rpmi1640培养基洗涤后，使其以4×104cells/ml浮游在培养基中。将此100μl分注到组织培养用96孔板的各孔中，进而，将用含有fcs的rpmi1640培养基稀释的peg-rhil-2及未修饰的rhil-2样品液加入到各100μl孔中进行培养。培养开始20小时后，用含有nen社制“methyl-3h”thymidine(740gbq/mmol)的rpmi1640培养基稀释，将370gbq/50μl加入到各孔中，进而培养4小时。培养后，用packard社制“matrix96directbetacounter”测定进入的放射活性。其结果，peg-rhil-2对rhil-2的比活性是97％，rhil-2的修饰体保持着il-2活性。实施例9结合聚乙二醇(peg)的rhil-6的制备将溶解在10mm柠檬酸钠缓冲液(ph6.0)中的rhil-6溶液(1.75mg/ml)用200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5)进行稀释，配制5μm的蛋白质溶液，在此溶液中(2.5ml)，添加75mg的聚氧乙烯双(6-氨基己基)(分子量3350、sigma社制)，37℃下予培养。向此反应液中添加250μl的btg溶液(220u/ml200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5))，37℃下培养2小时。使用“ymcc8ap”柱(山村化学社制)的反相hplc精制反应液。除去未反应的rhil-6级分。使用phastsystem(pharmacia社制)的sds-page(monogenious20凝胶)分析精制物的纯度。其结果，用peg的修饰体(peg-rhil-6)比未修饰体，结合了1个分子的peg并且只是在其予想程度上升的位置上，确认了来自蛋白质的带(图7)。图7中1表示分子量标记、2表示rhil-6、3表示结合peg的rhil-6。实施例10结合聚乙二醇(peg)的rinf-α-2b的配制将rinf-α-2b的冷冻干燥物(山之内制)溶解在200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5)中，在此配制溶液中(2.5ml)，添加22.5mg的聚氧乙烯双(6-氨基己基)(分子量3350、sigma社制)，37℃下予培养。向此反应液中添加250μl的btg溶液(220u/ml200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5))，37℃下培养2小时。使用phastsystem(pharmacia社制)的sds-page(monogenious20凝胶)分析反应液。其结果，用peg的修饰体(peg-rinf-α-2b)比未修饰体，结合了1个分子的peg并且只是在其予想程度上升的位置上，确认了来自蛋白质的带(图8)。图8中1表示分子量标记、2表示rinf-α-2b、3表示修饰peg的反应液。3的43.0附近的斑点是反应液的btg。67.0kda以上的斑点是原料rine-α-2b中的人血清白蛋白(hsa)。实施例11结合聚乙二醇(peg)的radf的配制将radf的冷冻干燥物溶解在200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5)中，配制5μm的蛋白质溶液，在此配制溶液中(2.5ml)，添加22.5mg的聚氧乙烯双(6-氨基己基)(分子量3350、sigma社制)，37℃下予培养。向此反应液中添加250μl的btg溶液(220u/ml200mmtris-盐酸缓冲液(ph7.5))，37℃下培养2小时。使用phastsystem(pharmacia社制)的sds-page(monogenious20凝胶)分析反应液。其结果，用peg的修饰体(peg-radf)比未修饰体，结合了1个分子的peg并且只是在其予想程度上升的位置上，确认了来自蛋白质的带(图9)。图9中1表示分子量标记、2表示radf、3表示修饰peg的反应液。3的43.0附近的斑点是反应液的btg。权利要求1.生物活性肽或生物活性蛋白质的修饰方法，其特征在于将至少具有谷氨酰胺残基的生物活性肽或生物活性蛋白质和具有氨基供体的物质，在来自微生物转谷氨酰胺酶的存在下进行反应，在该谷氨酰胺残基的γ-位酰胺上形成该氨基供体的氨基和酰胺键。2.根据权利要求1所述的肽或蛋白质的修饰方法，其特征在于具有氨基供体的物质是聚赖氨酸、单克隆抗体或聚乙二醇的烷基胺衍生物中的一种。3.根据权利要求1或2所述的肽或蛋白质的修饰方法，其特征在于具有谷氨酰胺残基的生物活性蛋白质是白细胞介素2或6、干扰素或adf(atlderivedfactor、人硫氧还蛋白)中的一种。4.用权利要求1所述的方法制造的肽和蛋白质的修饰体。5.根据权利要求4所述的肽或蛋白质的修饰方法，其特征在于氨基供体的物质是聚赖氨酸、单克隆抗体或聚乙二醇的烷基胺衍生物中的一种。6.根据权利要求4或5所述的肽或蛋白质的修饰方法，其特征在于具有谷氨酰胺残基的生物活性蛋白质是白细胞介素2或6、干扰素或adf(atlderivedfactor、人硫氧还蛋白)中的一种。全文摘要本发明涉及生物活性肽或生物活性蛋白质的修饰方法，其特征在于将至少具有谷氨酰胺残基的生物活性肽或生物活性蛋白质和具有氨基供体的物质，在来自微生物转谷氨酰胺酶的存在下进行反应，在该谷氨酰胺残基的γ-位酰胺上形成该氨基供体的氨基和酰胺键。文档编号c07k14/555gk1165539sq9519539公开日1997年11月19日申请日期1995年9月29日优先权日1994年9月29日发明者高原义之,山田尚之,本木正雄申请人:味之素株式会社