专利名称：由酵母生产和分泌重组血纤维蛋白原的制作方法
政府权利本项工作得到联邦政府部分资助，批准号为hl37457。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及重组血纤维蛋白原、血纤维蛋白原变体及其亚基的一种新表达系统、用该表达系统转化的酵母、利用该表达系统克隆血纤维蛋白原、血纤维蛋白原变体及其亚基的用途，以及利用重组血纤维蛋白原、血纤维蛋白原变体及其亚基作为研究工具或在医学上，例如在诊断测定中或作为治疗某些适应症的治疗手段的用途。
2.对相关技术的描述血纤维蛋白原是血纤维蛋白的可溶性前体，为血块的主要成分。对血纤维蛋白原的结构已进行广泛的研究。关于其结构，可参见m.furlon的“血纤维蛋白原、血纤维蛋白稳定作用和血纤维蛋白溶解作用”、j.l.francis编著，chichester，ellis horwood，1988，17-64页；m及r.f.doolittle，1984，《生物化学年鉴》，53195。
血纤维蛋白原由三种不同的多肽链(称做aα、bβ和γ)构成，是以二聚体排列的且每个半分子含有一组每种链。两个半分子在多肽的氨基末端部分通过三个二硫键连接起来。两个对称键位于相邻γ链之间。另一个位于aα键之间。另外，一组综合的链间或键内二硫键(有29个二硫键，没有自由巯基)与保持适当的结构有关。
血纤维蛋白原基本为直线型，由限定于一较小中心区的两个末端两叶区域构成。多肽α，β和γ的氨基末端包含在中心区中并相连。
血纤维蛋白原对凝血酶是敏感的。凝血酶从血纤维蛋白原的α及β链的末端切割肽。所释放的链被分别称为血纤维蛋白肽a和b。从血纤维蛋白原α及β链的氨基末端去除血纤维蛋白原a和b可产生称为“血纤维蛋白单体”的实体，其自发性聚合可产生血纤维蛋白。
每一个血纤维蛋白单体在中心区都含有特定的聚合位点(或“结”)，其在血纤维白原中被血纤维蛋白肽a及b遮住。血纤维蛋白肽a及b的释放暴露了这些结，其带正电并可与位于邻近分子末端区上的互补性带负电的“洞”连接。
开始时，血纤维蛋白单体聚合而形成了双股原纤维，其中，一个分子的中心区与交迭的半分子中两个邻近分子的每一个之末端区缔合。这些原纤维在存在因子xiiia(血纤维蛋白稳定因子)和ca 的条件下相交联而形成血纤维蛋白。交联也可以由凝血酶催化，凝血酶可以使无活性的酶前体因子xiii转变为活性形式的因子xiiia。
血纤维蛋白凝块将成为临时性的密封剂，因而可作为正常愈伤过程的一部分被顶换。血纤维蛋白溶酶可降解血纤维蛋白凝块并且血纤维蛋白溶酶原转为血纤维蛋白溶酶可调整溶解的速度。最重要的血纤维蛋白溶酶原转变过程涉及到组织血纤维蛋白溶酶原激活子(t-pa)，它是从受损伤的内皮细胞中释放出来的。t-pa本身在激活血纤维蛋白溶酶原方面并不是非常有效，但是血纤维蛋白和各种血纤维蛋白分解产物的存在会极大地加快激活过程。
除了其在凝块形成中的作用，血纤维蛋白原还参与血小板的聚集作用。高亲和性“血小板识别位点”已经定位在两γ链(残基397-411)的相反末端处的亲水性羧基末端五十肽上。看来这个片段可形成适合血小板血纤维蛋白原受体的盐桥γ环。在血纤维蛋白原被血小板受体在任一γ末端结合以后，该分子就具有足够的“区域”以在其自由末端至相邻血小板上的血纤维蛋白原受体上形成桥路。而后，两个血小板上的受体彼此迁移，因而加强了桥路。另一些血小板类似地卷入，因而导致了网络的形成。
虽然血纤维蛋白原的主要功能是凝块形成和血小板降聚集，但血纤维蛋白原也与广泛种类的其它蛋白质和细胞相互作用。例如，当受到刺激或损伤时，沿血管系统排列的内皮细胞也会结合血纤维蛋白原。血纤维蛋白原上的内皮细胞的主要结合位点似乎与结合血小板时所涉及的位点是相同的。参见d.a.cheresch等人，1989，“细胞”，58945。另外，在能够“凝聚”某些金黄色葡萄球菌菌株的血浆蛋白质之中，血纤维蛋白原是独特的。血纤维蛋白原上的主要“凝聚”位点似乎也与结合血小板时所涉及的那些位点是相同的。参见j.hawiger等人，1982，“生物化学”，211407。
哺乳动物体内主要(也许是唯一)的血纤维蛋白原生物合成位点是肝脏。肝细胞是合成的主要位点，而血纤维蛋白原的每一个组分链是由一个独立的基因编码的。这些基因被表达，链缔合，形成适宜的二疏链，六聚体被释放到循环系统中并转运至内质网中，在那里它们被糖基化、磷酸化以及硫酸化。
由于其临床结果或在常规筛选过程中，已经鉴定出了数百种天然存在的血纤维蛋白原变体。这些变体对于了解血纤维蛋白原-血纤维蛋白的生物化学十分有益，在许多情况下对了解结构-功能关系提供了重要帮助。虽然天然存在的变体具有价值，但它们不久就要因利用在重组系统中表达的重组性血纤维蛋白原而进行的位点针对性诱变实验而变得相形见绌。
例如，为了研究在二硫键γcys326-γcys339的钙结合中的作用，有一家实验室已经利用位点针对性诱变通过在大肠杆菌中表达编码修饰多肽的dna合成了一种缺乏cys326及cys339的多肽。参见m.g.bolyard等人，1990，“生物化学及生物物理研究通讯”，174853。
有趣的是，在凝血能力中也牵涉到相同的γcys326-γcys339键。r.procyk等人(1990，“生物化学”，291501-1507)表明，该键是在缺少钙的条件下在用低浓度二硫苏糖醇对血纤维蛋白原进行适度还原期间发生断裂的键之一。有限的还原的结果是凝血能力的丧失，后来确定了这显然是由血纤维蛋白原上的羧基末端聚合位点的微扰造成的。这种羧基末端聚合位点的微扰又显然是γcys326-γcys339键断裂的后果。参见r.procyk等人，1992，“生物化学”，312273。共同未决的美国专利申请no.071946，826(其全部内部合并于本文作为参考)授说，以该方式还原的血纤维蛋白原具有与血纤维蛋白及血纤维蛋白单体基本相同的生化和免疫学等价性，因此在需要这些种类的测定中可用作血纤维蛋白或备纤维蛋白单体的替代物。这样的测定包括，例如，对下列项目的常规定量测定(i)血纤维蛋白单体，(ii)血纤维蛋白溶酶激活子抑制剂活性，(iii)组织血纤维蛋白溶酶原激活子活性，(iv)免疫测定。
利用位点针对性诱变来构建编码这种还原性血纤维蛋白原或一些另外的血纤维蛋白原变体的dna序列，然后构建含有这种dna的表达载体，用这种表达载体来转化适宜的宿主并随后诱导该宿主以表达dna，这样做是可行的。
我们的实验室及其他人士已描述过转染的动物细胞产生重组血纤维蛋白原的系统。参见s.n.roy等人，1991，生物化学杂志，2664758(在cos-1及hep g2细胞中的表达)；r.hartwig等人，生物化学杂志，2666578(在cos-1细胞中的表达)及d.h.farrell等人，1991，生物化学，309414[在幼仓鼠肾(bhk)细胞中的表达]。然而，这些系统只能产生少量的血纤维蛋白原，其很难形成规模化。
作为研究工具，重组血纤维蛋白原无疑是很有用的，而且除此之外在医学上也是很有用的，例如在制备用于伤口愈合或在某些病例中用于输入血纤维蛋白原过少患者体内的“血纤维蛋白胶”方面。
本发明概述本发明的主要目的在于提供一种用于较大量地表达重组血纤维蛋白原、重组血纤维蛋白原变体及重组血纤维蛋白原亚基的系统。
本发明的另一个目的是提供一种重组血纤维蛋白原，重组血纤维蛋白原变体及重组血纤维蛋白原亚基的表达系统，该系统容易形成规模化。
本发明还有一个目的就是提供重组血纤维蛋白原、重组血纤维蛋白原变体及重组血纤维蛋白原亚基以及这类重组蛋白质在研究中和在医学中作为治疗手段不在诊断测定中的应用。
这些及其它目的与在本发明相符合，本发明一般涉及到含有至少一种编码血纤维蛋白原或其变体的多肽链的cdna的酵母的表达载体。一种具体实例包括含编码血纤维蛋白原或其变体的aα链的cdna、编码纤维蛋白原或其变体的bβ链的cdna及编码血纤维蛋白原或其变体的γ链的cdna的酵母的表达载体。
本发明的第二个具体实例涉及用这种载体转化的酵母。
本发明的第三个具体实例包括在酵母中表达血纤维蛋白原或其变体或亚基的方法，包括以下步骤(a)构建或得到含至少一种编码血纤维蛋白原或其变体的多肽链的cdna的酵母的表达载体；(b)用所述表达载体转化酵母，筛选稳定的转化体；(c)将转化体保持在培养基中，条件为使血纤维蛋白原或其变体或亚基分泌到上述培养基中；和(d)从培养基中回收血纤维蛋白原或其变体或亚基。
本发明的第四个具体实例涉及通过本发明方法产生的重组纤维蛋白原或其变体或亚基。
与可能使用的其它表达系统相比，本发明的酵母系统可令人惊奇地产生至少多10倍的重组血纤维蛋白原。另外，采用本发明的酵母系统很容易生产大量的重组血纤维蛋白原。此外，利用本发明的酵母系统，重组血纤维蛋白原是主要的分泌蛋白质，因而很容易从培养基中纯化出来。
附图的简要说明
图1的质粒pyes2图谱。
图2表示人血浆及酵母重组血纤维蛋白原的sds-page及western印迹分析。
图3表示人血浆及酵母重组血纤维蛋白原的凝血酶诱导性凝血及交联的sds-page和western印迹分析。
本发明详述本发明提供了重组人血纤维蛋白原或其变体或亚基，其可以用于研究或用作医学上的治疗手段或用作诊断测定的试剂。“血纤维蛋白原变体”或简称“变体”意指实质上具有人血纤维蛋白原氨基酸序列的多肽，但其中已通过常规方法有目的地进行了一个或多个插入、缺失、增加和/或置换。“血纤维蛋白原亚基”或简称“亚基”意指具有人血纤维蛋白原或血纤维蛋白原变体的单体α，β或γ链或者除含每两种链的完整分子外的这些链的任意组合的氨基酸序列之多肽。这些链的各种组合可作为研究工具用于研究功能蛋白质的生物合成和组装。
人血纤维蛋白原的α、β及γ链的cdna已经得到分离和表征。可分别参见m.w.rixon等人，1983，生物化学，223237；d.w.chung等人，1983。生物化字，223244；以及d.w.chung等人，1983，生物化学，223250。然而，由于密码简并，在编码相同氨基酸序列的核苷酸序列中会有相当大的变异。对于本发明的目的而言，当提到“编码血纤维蛋白原多肽链的cdna”时，这种“简并变体”也可以利用和予以考虑。这里所用的术语“简并变体”指由于遗传密码的简并性而可以编码与另一种dna序列所编码者相同的氨基酸序列的任何dna序列。
本发明还提供在酵母中产生有用量的纯化血纤维蛋白原或其变体或亚基的表达载体。这里所使用的术语“酵母”意欲包括任何酵母菌株，尤其是酿酒酵母或栗酒酵母，还包括其它属的菌株(如毕赤酵母属或克鲁维酵母属)，它们也已被用作生产重组蛋白质的菌株。
一般来说，该载体可含有至少一种编码血纤维蛋白原或其变体多肽链(α、β和/或γ)的cdna，它可操作地联结于来自酵母的调节元件上。酵母细胞系用该载体转化之后，可以诱发该载体表达所编码的多肽链或当该载体含有所有三种链时表达适当组装的血纤维蛋白原或其变体。酵母中所使用的载体是领域技术人员所熟悉的。该载体包括所谓的“穿梭载体”，其在大肠杆菌和酵母中都可以复制。对该载体的一般描述见j.d.watson等人，重组dna，第2版，纽约，w.h.treeman及company，1992，235-253页。对该载体以及酵母遗传学基本技术(包括酵母培养基的制备、菌株贮存和再生、菌株生长和操作、诱变、高效转化、可选择标记物、表达暗盒、复制子、启种子、引导子、终止子、分泌的信号序列等等)的详细描述见f.m.ausubel等人，(编著)“酿酒醇母”，引自f.m.ausubel等人(编著)，“分子生物学的简短方案”，第2版，纽约，john wiley和sons，1992，13-1-13-49页，其全部内容合并于此供参考。
一般来说，酵母既可以在液体培养基中也可以在固体琼脂平板表面(或包埋其中)生长，但优选液体培养。酵母最好是生长在含葡萄糖、氮、磷、痕量金属及蛋白质和酵母-细胞提取液水解产物的液体培养基上，该培养基可以提供细胞正常性全面合成所需的氨基酸、核苷酸前体，维生素及其它代谢物。除葡萄糖以外，酵母也可在多种其它碳源上生长，例如半乳糖、麦芽糖、果糖及棉子糖。在特别优选的实施方案中(下面将详述)，我们在gal-1启动子元件的控制下进行转录，其可用半乳糖来诱导。培养基应进行灭菌(如在151b/in2下高压灭菌15分钟，而制备大量培养基时该消毒时间还需延长)。在这种培养基上进行培养时，酵母细胞大约每90分钟分裂一次。
依据其在酵母中的复制模式，酵母载体可分成五大类yip(酵母整合质粒)、yrp(酵母复制质粒)、ycp(酵母着丝粒质粒)、yep(醇母附加型质粒)和ylp(酵母线性质粒)。除ylp之外，其余都是穿梭载体。yip质粒含可选择的醇母基团，但缺少可使质粒在酵母中自我复制的序列。相反，可经过把yip质粒整合入酵母基因组中而发生酵母的转化。yrp质粒含有来自酵母基因组(它可以赋予自我复制的能力)的序列。yrp质粒具较高的转化频率(103-104转化体/μgdna)，但有时转化体在有丝分裂和减数丝分裂期间是不稳定的。ycp质粒含有来自酵母着丝粒的dna片段，它可以极大地提高减数分裂和有丝分裂期间的稳定性。ylp质粒在其末端含某些富含g的重复序列，其行使端粒的功能，可使质粒复制成线性分子。然而，对本发明的目的来说，yep质粒是优选的。这些质粒含有来自称为“2μm圈”的天然存在的酵母质粒的序列。这些2μm序列可使染色体外复制发生并赋予高转化效率(～104-105转化体/μgdna)。在减数分裂和有丝分裂期间这些质粒是相对稳定的，因而一般可用于酵母的高水平基团表达。
一般来说，异源结构序列是在具转译起始及终止序列、可选择的标记物及优选地能够指导转译蛋白质分泌入胞外培养基中的先导序列的适宜的阅读框架中进行组装的。通常使用的可选择标记物为野生型基因，如ura3、leu2、his3及trp1，以及最好是一齐利用。这些基因可补偿酵母宿主中的特殊代谢缺陷(营养缺陷体)，因而可在选择性培养基上根据其生长情况鉴别出成功的转化体。在优选的实施方案中(下面将详细描述)，使用的是mf21先导序列。虽然其它序列也同样可用。使用mfα1先导序列时，异源蛋白质被酵母kex蛋白质切掉。正如w.fiers等人建议的(见“医学研究及临床应用上具重要意义的异源蛋白质在微生物中的分泌及表面表达”，引自“驾驭21世纪的生物技术”，m.r.ladisch等人编著，美国化学学会，1992，23-25页)，在这些案例中，把一或两个glu-ala二肽置于前序列和异源基因序列之间可能是有益处的，这样做可以促进前序列的断裂。
上述所有载体都可以携带rna聚合酶ii所使用的强启动子。该启动子既可以是诱导性的(如gal-1，gal-10，ph0.5)，也可以是组成性的(如adhi，pgk或gpd)。由这些启动子的转录依赖于结合于转录起始位点上游的位点(在酵母中，被称为上游激活位点或usa)的激活蛋白。优选gal启动子，特别是gal-1(半乳糖激酶)启动子。gal启动子受到激活子gal-4(结合于转录起点的uas上游)和负调节子gal-80(它通过激活子来抑制活化作用)的调节。当细胞在含半乳糖(作为唯一碳源)的培养基中生长时，例如可大规模诱发由gal-1启动子的转录；在这些条件下gal-80与gal-4解离，而gal-4则与gal-1 uas相结合。因此，优选的是连同含作为唯一碳源的半乳糖的培养基一起使用gal-1启动子。
适宜的酵母转化方案是本领域的技术人员所熟悉的；酵母转化药盒可购自bio 101公司(la jolla，ca)，在以下的实施例中对药盒方案略有修改。gal-1启动子的脱阻抑发生在培养基中半乳糖耗尽时。而后用过滤法收获粗酵母上清液。在进一步纯化之前在约4℃条件下放置。
在优选的实施方案中，我们利用表达载体pyes2已达到了较高的产量，其构建的详细情况如下列实施例所描述。载体pyes2是用全部三种血纤维蛋白原cdna串联而构建成的，每一种都在与mfα1前原分泌信号级联融合的gal-1-启动子元件的控制下。正如以下将详细讨论的那样，在聚丙烯酰胺凝胶上分析时，分泌自酵母的同重组血纤维蛋白原同血浆血纤维蛋白原是相似的；另外，同天然存在的血浆血纤维蛋白原一样，分泌自酵母的重组血纤维蛋白原能够形成凝血酶诱导的凝块。
在酵母系统中，血纤维蛋白原是培养基中的主要分泌蛋白质，因而可以很容易地通过常规的蛋白质纯化方法进行纯化，例如可通过盐析、超滤、透析、离子交换层析、凝胶过滤、电泳、亲和色谱法等配合进行。
通过把酵母细胞与每种血纤维蛋白原cdna在单独的表达载体中(而非一前一后地在单一的载体中)共转染，也有可能得到适宜组装的血纤维蛋白原。如果利用这个具体实例，那么每一载体必须要含不同的选择载体，以便于含全部三种cdna的稳定转化体的选择。
对于血纤维蛋白原变体或变体亚基的制备来说，利用常规诱变技术改变天然cdna的dna序列。例如，可以使用寡核苷酸针对性位点特异性诱变程序提供一种改变的“基因”，它具有因所需置换、缺失或插入而改变的特别密码子。在欲将血纤维蛋白原变体用于研究的领域，可利用具有简并寡核苷酸的盒式诱变在单个实验中建立大批随机突变。这些技术的细节是本领域的普通技术人员熟知的。在此不再重复。不过，可参考j.d.watson等人，如上述，191-211页；f.m.ausubel等人，如前述，8-1页8-25页；j.sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二版，plainview，纽约，冷泉港实验室出版社，1989，15-1至15-113页，每篇文献的全部内容都合并于此做参考。
这样，如上面所述，在凝血能力中牵涉到γcys326-γcys339键。对于多种诊断测定来说，需要使用在测定中不会凝块的试剂，使该试剂在生化及免疫上与血纤维蛋白或血纤维蛋白单体是难区分的。根据美国专利申请no.07/946,826(如前述)，可通过对血纤维蛋白原进行有限的还原处理而得到适用于本目的的试剂，依据r.procyk等人，1992(如前述)，这样做可引起某些cys-cys键的断裂。通过重组方法有可能制备出这种“还原性血纤维蛋白原”。比如，利用寡核苷酸针对性位点特异性诱发程序，有可能通过用其它氨基酸(例如甘氨酸或也许还有甲硫氨酸，同半胱氨酸一样，其为疏水性的，并在侧链中含硫)的密码子置换在有限的还原过程中发生断裂位置上的半胱氨酸密码子来修饰编码各种链的cdna。
另外，重组血纤维蛋白原及其变体还可作为治疗剂而用于医学中。血纤维蛋白原是“急性期蛋白”中的一种，其生物合成在受创伤及损害时会显著增加。参见r.f.doolittle“血纤维蛋白的分子生物学。引自g.stamatoyanropoulous等人(编著)的”血液疾病的分子基础，第2版，费城，w.b.saunders公司，1994，712页。在患肝衰竭或散布性血管内血凝固(dic)的患者或患先天性血纤维蛋白原缺乏症患者中可能需要血纤维蛋白原补充。目前，施用低温沉淀的抗血发病因子(ahf，亦称为因子viii)是血纤维蛋白原补充的优选治疗方法。每袋低温沉淀的ahf含有约250mg血纤维蛋白原。血纤维蛋白原的血浆水平为至少50mg/d1是手术或外伤充分止血所必需的。参见m.s.kennedy“转输疗法”，引自d.harmening-pittiglion等人(编著)，“现代血库及转输实践”，第2版，费城，f.a.davis公司，1989，268页。给这样的患者施用重组血纤维蛋白原或其变体将通过静脉内途径，其典型日剂量需保持在血纤维蛋白原的最低血浆水平50mg/d1。为了这样的目的，可以把重组血纤维蛋白原或其变体加入全血或血液产物，如血浆，低温沉淀物等等中，或加入常规的药物媒介中。
参考下列非限制性实施例可更详细地描述本发明。
材料从invitrogen公司得到表达载体体(pyes2)和酵母菌株(in8vc1 matα his3-δ1 len 2 trp-1-289 ura 3-52)。从bio 101公司购得在选择性条件下生长酵母的培养基。从sigma得到半乳糖、棉子糖、衣霉素。人血纤维蛋白质的抗体来自dako公司，限制酶、klenow片段、小牛肠道磷酸酶(cip)来自boehringer，mannheim，内切糖苷酶-h来自genzyme，t4 dna连接酶来自新英格兰生物实验室，l-[35s]甲硫氨酸(1100 ci/mmol)来自新英格兰核公司-杜邦。所使用的其它试剂如前所述[参见s.n.roy等人，生物化学杂志，26723151(1992)；s.n.poy等人，生物化学杂志，269691(1994)；s.n.roy等人，生物化学杂志，266；4758(1991)]。
实施例1表达载体的构建将含单链、组合2链及全部3链的血纤维蛋白原cdna的表达载体插入gal-1启动子(与pyes2质粒中mfα1前原分泌信号(ss)级联相隔合)3’末端处的多克隆位点，如图1所示。为了制备pyes2aαpyes2bβ和pyes2γ，用分别来自上述构建体的适宜的限制酶来释放全长cdna[参见s.n.roy等人，生物化学杂志，269691(1994)；s.n.roy等人，生物化学杂志，2664758(1991)]。通过串联连接血纤维蛋白原链cdna制得其它构建体pyes2aαbβ、pyes2aαγ、pyes2bβγ和pyes2aαbβγ，各链均在gal-1-ss启动子的控制之下。从琼脂糖凝胶中洗脱dna片段、用cip对质粒进行去磷酸化，用klenow片段进行补平反应和连接的操作程序如另述[参见s.n.roy等人，生物化学杂志，26723151(1992)；s.n.roy等人，生物化学杂志，269691(1994)；s.n.roy等人，生物化学杂志，2664758(1991)]。
实施例2酵母的转化通过碱性阻离子方法，用含血纤维蛋白原cdna的pyes2载体来进行酿酒酵母(invsc1)的转化，并将细胞涂布在sc-ura平板上培养[参见l.d.schultz等人，基因，54113(1987)]。将得自每一平板的单一菌落在sc-ura培养基(含4％的棉子糖)上生长，温度30℃，强烈震荡过夜，作为贮存培养物保存。用上述构建体转化的酵母细胞被命名为invsc1aα，invsc1bβ和invsc1γ、invsc1aαbβ、invsc1aαγ、invsc1bβγ和invsc1aαbβγ。
用前述方法制备出用载体pyes2aαbβγ稳定转化的酿酒酵母细胞(invsc1)并保藏于美国典型培养物保藏中心(马里兰州罗克维尔市)，保藏日为1994年8月12日，注册号为atcc 74296。该保藏是遵循布达佩斯条约进行的。
实施例3用衣霉素进行表达和处理将贮存培养物在5ml的sc-ura培养基中生长过夜，密度为1×108/ml。以500xg收缩细胞，重悬浮在含2％半乳糖的sc-ura培养基中，再生长16小时来诱发血纤维蛋白原链合成。以500xg收获细胞，重悬浮在含50μci/ml l-[35s]甲硫氨酸的sc-ura-met培养基中，在30℃下温育1小时。在某些情况下，用含10μg/ml衣霉素的培养基对细胞预温育1小时并照例加入l-[35s]。当确定胞内血纤维蛋白原时，收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗，用0.5ml的ip缓冲液(50mmtris.hcl，ph7.4，190 triton x-100，0.2％sds，150mm nacl，5mmedta，10u/ml trasylol，1mm pmsf，0.1mm tpck，1μg/ml大豆一胰蛋白酶抑制剂)和200mg(0.5mm直径)的酸洗玻璃珠/108细胞涡旋搅拌2次，进行溶胞，时间为45秒[见j.r.tranzusoff等人，酶学方法，194662]。用水把胞溶产物稀释到1ml，以15000xg在4℃下离心15分钟。如其它文献所述用人多克隆血纤维蛋白原抗体免疫沉淀细胞溶质而分离出血纤维蛋白原(参见s.n.roy等人，生物化学杂志，26723151(1992)；s.n.roy等人，生物化学杂志，269691(1994)；s.n.roy等人，生物化学杂志，2664758(1991)。
实施例4血纤维蛋白原的分泌把用pyes2aαbβγ，转化并由单一菌落生长的酵母细胞接种到50ml含4％棉子糖的sc-ura培养基中并在30℃下生长过夜。然后用2％半乳糖诱导细胞，另外再温育16小时。在室温下以500xg将培养基离心15分钟。用1m tris-hcl缓冲液(ph8.0)把培养基ph值调到7.0，加入蛋白酶抑制剂混合物(10u/ml trasylol，1mm pmsf，0.1mm tpck，1μg/ml大豆-胰蛋白酶抑制剂，1mg/mlpapstatin)。利用硫酸鱼精蛋白一琼脂糖6b柱[10ml，用缓冲液a(50mm tris.hcl，ph7.4，5mm edta)标定]上的吸附作用从培养基中分离出血纤维蛋白原。用含0.8m nacl的缓冲液a冲洗柱，用0.1m的乙酸钠(ph4.5)洗脱结合的血纤维蛋白原。用1m tris.hcl(ph8.0)将其ph调到7.0[参见c.e.dempfle等人，血栓形成研究，4619(1987)]。
实施例5分泌性血纤维蛋白原的定量测定利用两种不同的血纤维蛋白原链特异性单克隆抗体[1-8c6(抗bβ1-21)和fd-7b3(抗血纤维蛋白原片段d)]，通过竞争性elsa测定了从培养基中分泌出的血纤维蛋白原的量。利用fd4-7b3进行测定的细节以前已有过报导[参见s.n.roy等人，生物化学杂志，2664758(1991)]。最近已经开发出一种利用抗体1-8c6的新测定法，该抗体的特异性已有人做过描述[参见b.kudryk等人，分子免疫，201191(1983)]。在这种测定法中利用了辣根过氧化物酶标记形式的抗体1-8c6，可以很容易地测定到低至0.05μg/ml的血纤维蛋白原浓度。
实施例6人血浆与酵母重组血纤维蛋白原二者特性的比较利用凝血酶(6.8nih u/ml)及用或不用因子xiii(1.0u/ml)来处理所分泌的重组血纤维蛋白原，以确定其形成凝血酶诱导性血块及交联的能力。通过sds-page分离血纤维蛋白复合体，利用考马斯蓝染色和利用链特异性抗体1c2-2(抗血纤维蛋白原aα/血纤维蛋白α)(r.procyk等人，血栓研究，71127(1993))、ea3(抗血纤维蛋白原bβ/血纤维蛋白β)(b.kudryk等人)，“作为血纤维蛋白(原)蛋白水解探针的单克隆克体”，引自免疫闪规照相法中的单克隆抗体，(j.f.chatal(编著)，crc出胶社，boca raton，fl，365-398页)、t2g1(抗血纤维蛋白β)(b.kudryk等人，分子免疫，2189(1984))和4-2(抗血纤维蛋白原γ/血纤维蛋白γ-二聚体)(r.procyk等人，血液，771469(1991))通过western免疫印迹法来进行检测。
为了评估酵母重组血纤维蛋白原与人血浆血纤维蛋白原的相似性，在聚丙烯酰胺凝胶上进行了两种产物的比较。
图2表明重组血纤维蛋白原与链特异性抗体的免疫反应性。在还原或非还原条件下，在4-10％梯度sds-page上分离重组血纤维蛋白原，利用不同的链特异性抗体通过western免疫印迹法进行分析。
框a用考马斯蓝染色的还原凝胶。
框b与mab到aα/α链反应的还原样品的免疫印迹。
框c同b，与mabbβ/β链进行反应。
框d同b，与mab至γ链进行反应。
框e与mab至γ链反应的非还原性样品的免疫印迹。
泳道1，分子大小标记物；泳道2，血浆fbg；泳道3，重组酵母fbg。
数据表明，由转化的酵母细胞分泌的重组血纤维蛋白原与血浆血纤维蛋白原具有类似的电泳和免疫反应特性。
图3表示重组酵母血纤维蛋白原的凝血特性。使用凝血酶或凝血酶＋因子xiii对酵母细胞所分泌的纯化重组血纤维蛋白原进行温育(温度37℃)4小时。凝血后，把每个样品溶解于含dtt和sds的缓冲液中，通过sds-page(5-15％梯度凝胶)进行分离，用mab(它可与血纤维蛋白β链或与血纤维蛋白原γ链或血纤维蛋白γ-二聚体反应)来进行western印迹分析。
框a用马考斯蓝染色的免疫印迹。
框b与血纤维蛋白β-链(t2g1)抗体反应的免疫印迹。
框c与血纤维蛋白原γ链/血纤维蛋白γ-二聚体(4-2)抗体反应的免疫印迹。
泳道1，分子大小标记物；泳道2，血浆fbg；泳道3，酵母fbg；泳道4，由酵母fbg制备的非交联性血纤维蛋白；泳道5，由酵母fbg制备的因子xiii交联血纤维蛋白。
数据显示，像血浆血纤维蛋白原一样，重组血纤维蛋白原能够形成凝血酶诱导性凝块并发生因子xiii诱导性交联。
应该认识到，通过本说明书和权利要求是以说明和非限制性方式叙述的，可以在不背离本发明宗旨和范围的条件下做出多种改动和变化。
权利要求
1.一种酵母的表达载体，其含有至少一种编码血纤维蛋白原或其变体的多肽链的cdna。
2.依据权利要求1的表达载体，含有编码血纤维蛋白原或其变体aα链的cdna，编码血纤维蛋白原或其变体bβ链的cdna，编码血纤维蛋白原或其变体γ链的cdna。
3.依据权利要求2的表达载体，其为2pyes2表达载体，其中在t7启动子3’末端已一前一后地插入了三种cdna。
4.依据权利要求3的表达载体，其中三种cdna至gal-1启动子的控制之下。
5.用依据权利要求1的表达载体所转化的酵母。
6.用依据权利要求2的表达载体所转化的酵母。
7.用依据权利要求3的表达载体所转化的酵母。
8.用依据权利要求4的表达载体所转化的酵母。
9.在酵母中表达血纤维蛋白原或其变体或亚基的方法，包括(a)构建或得到酵母的表达载体，其含有至少一种编码血纤维蛋白原或其变体之多肽链的cdna；(b)用所述表达载体转化酵母并筛选稳定的转化体；(c)将转化体保持在培养基中，条件为使血纤维蛋白原或其变体或亚基分泌到所述培养其中；和(d)从培养基中回收血纤维蛋白原或其变体或亚基。
10.依据权利要求9的方法，其中所述表达载体含有编码血纤维蛋白原或其变体aα链的cdna，编码血纤维蛋白原或其变体bβ链的cdna，编码血纤维蛋白原或其变体γ链的cdna。
11.依据权利要求10的方法，其中所述表达载体是pyes2表达载体，其中在t7启动子3’末端已一前一后地插入了三种cdna。
12.依据权利要求11的方法，其中三种cdna处于gal-1-启动子的控制之下。
13.依据权利要求9的方法所产生的血纤维蛋白原或其变体。
14.依据权利要求10的方法所产生的血纤维蛋白原或其变体。
15.依据权利要求11的方法所产生的血纤维蛋白原或其变体。
16.依据权利要求12的方法所产生的血纤维蛋白原或其变体。
全文摘要
本发明涉及重组血纤维蛋白原，血纤维蛋白原变体及其亚基的一种新表达系统，用该表达系统转化的酵母，利用该表达系统克隆血纤维蛋白原，血纤维蛋白原变体及其亚基的用途，以及利用重组血纤维蛋白原、血纤维蛋白原变体及其亚基作为研究工具或在医学上，例如在诊断测定中或作为治疗某些适应症的治疗手段的用途。与可能使用的其它表达系统相比、本发明的酵母系统能产生至少多10倍的重组蛋白质。另外，本发明的酵母系统很容易用来生产大量的重组蛋白质。而且，利用本发明的酵母系统，重组血纤维蛋白原是主要的分泌蛋白质，因而很容易从培养基中纯化。
文档编号c07k14/75gk1159206sq95195339
公开日1997年9月10日 申请日期1995年9月1日 优先权日1994年9月2日
发明者s·n·罗伊 申请人:纽约血库公司