专利名称：产油微生物及改良这些微生物的方法
产油微生物及改良这些微生物的方法本申请要求以2006年8月1日提交的美国临时申请60/821，084作为优先权基础， 该临时申请通过引用的方式全文纳入本文。
背景技术：
大量科学证据表明，(n-3)高度不饱和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(dha)对心血 管疾病、慢性炎症和脑障碍有积极作用；而二十碳五烯酸——也是n-3脂肪酸一一已经被 发现作为二十酸类固醇例如前列腺素、白三烯等的中间代谢产物发挥功能。目前，这些高度不饱和脂肪酸的主要来源是鱼，已注意到多种深蓝色鱼类(例如 沙丁鱼和鲔鱼)体内的epa和dha的量分别为约20%和10%。这种脂肪酸分配比例的出 现被认为是经过对最佳比率的自然选择以在每种鱼有最适性能。然而，若要使用鱼油作为 这些脂质的唯一来源尚存在一些缺点，例如串味、不能稳定利用以及天然鱼油含量存在差 异等问题。另外，若想从这些来源获得高度纯化的(n-3)或(n-6)油，优先地分离和纯化会 非常困难。
发明内容
所公开的是涉及真核生物破囊壶菌目(thraustochytriales)和破囊壶菌科 (thraustochytriaceae)的组合物和方法，所述真核生物在培养时可产生大量不饱和脂肪 酸例如ω 3 (n-3)和/或ω 6 (n-6)油，如dha、epa和dpa，由于所有这些组合物可被使用， 并且由于其生产方式，它们均能被纯化和使用。所公开的是涉及产油微生物的组合物和方法，所述微生物在被培养时可产生大量 不饱和脂肪酸例如ω 3 (n-3)和/或ω 6 (n-6)油，如dha,epa和dpa，由于所有这些组合物 可被使用并且由于其产生方式，它们均能被纯化和使用。还公开的是使用以下的脂肪酸生产拮抗剂来改良所述脂肪酸在总脂质组合物中 浓度的方法，所述拮抗剂可抑制或刺激被认为存在于产油微生物中的经典脂肪酸生产途径 的某些组件。
被纳入并构成本说明书的一部分的附图阐述了几个实施方案，并与说明书一起对 所公开的组合物和方法进行了阐述。图1示出所公开的产油微生物产生多不饱和脂肪酸(pufa)的推定代谢途径。图2示出在以下3类不同发酵环境下于含有2g l—1酵母提取物、8g i^1l-谷氨酰 胺、6g γ1海盐和60g γ1葡萄糖的培养基中生长的0nc-t18的脂肪酸分配比例琼脂板 (1. 5%琼脂，25°c，27天)、烧瓶(250ml烧瓶中装有50ml，120rpm，25°c，3天)和5l生物反 应器(41pm 空气，p02 90%，25°c，3 天)。图3示出在装有培养基的5l生物反应器中维持168h的破囊壶菌属种0nc-t18的 典型生物量、总脂肪酸(tfa)、dha生产情况和葡萄糖利用情况，所述培养基含有60g l—1葡萄糖、2g l—1酵母提取物、8g l—1谷氨酸和6g l—1盐(41pm空气、p02 90%、25°c，ph7_9)。图4示出破囊壶菌属种0nc-t18与几个来源于日本的破囊壶菌(破囊壶菌属种 chn-i、破囊壶菌科菌种mbic 11093和破囊壶菌科菌种附-27)以及纹状破囊壶菌株t91-6 的基于18s rrna基因的进化亲缘关系。图5示出在各种氮源上培养0nc-t18，例如各纯度级酵母提取物、l-谷氨酸、玉米 浆等。l-谷氨酸单独不会促进生物量、总脂肪(tfa)或dha生产。然而，在存在l-谷氨酸 的情况下，包括酵母提取物和玉米浆的各种n源比没有l-谷氨酸时产生更好的结果(涉及 实施例11表7)。图6示出在各种碳源上培养0nc-t18，单糖例如葡萄糖等、蔗糖和糖蜜产生较高的 生物量、tfa和dha (涉及表6&7)。图7示出水溶性的抗氧剂、植物激素或乙酸钠(简单碳(simpiecarbon))与单独 标准培养基相比没有提高生物量、tfa或dha产出。图8示出0nc-t18在18°c和25°c下的发酵之间的差异。与对照培养物相比，所述 较低温度(即18°c )导致葡萄糖摄取显著升高，tfa减半，以及同等的生物量和dha水平。 因此已发现，在25°c下发酵比在18°c下更有效。图9示出用纯油酸培养0nc-t18。0nc-t18 (用纯油酸培养)的脂肪酸分配比例表 明大多数油酸被转化成dha，具有比葡萄糖培养的0nc-t18更高水平的epa。图10示出甲基苯甲酸对0nc-t18的脂肪酸组成的效应。0nc-t18 (用0. 2g/l的甲 基苯甲酸培养)的脂肪酸分配比例表明，该化合物能够增加所述分配比例中的epa比例，而 降低dpa(n6)的比例。值为将0.2g/l的甲基苯甲酸与对照相比较的4次实验的平均值。图11示出用示例的脂肪酸产物拮抗物培养的0nc-t18的气相色谱结果。图12示出添加氟草敏(norflurazon)对0nc-t18脂肪酸分配比例的效应。图12 示出pufa的比例随添加氟草敏量的量增加而增加。图13示出在0nc-t18暴露于氟草敏时，类胡萝卜素含量降低，同时dha增加。图14示出当将油酸添加至0nc-t18的培养基中时，观察到了更高的dha含量，特 别是当伴随着生长(通过存在高n和低n而表明)时。图15示出当将浅蓝菌素添加至0nc-t18的培养基中时，虽然没有观察到每种脂肪 酸占总脂肪酸含量的％变化，但是当将总脂肪酸浓度与生物量(mg/g)关联考虑时，则记录 到了 c16:0和dha的增加。
具体实施例方式在对本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法进行公开和描述之前，应理 解的是，除非另外指明，它们不限于特定合成方法或特定生物技术方法，或者除非另外指 明，它们不限于具体的试剂，其本身理所当然可有所改变。还应理解的是，本文所使用术语 其目的仅在于对具体实施方案进行描述，而无意于限定。本领域的技术人员将会认识到或仅使用常规实验就能确定，本文所描述方法和组 合物的特定实施方案的多种等价方案。这些等价方案旨在被囊括于下面的权利要求书中。a.定义本文中所用术语其目的仅在于描述特定实施方案，并不意欲进行限制。
除非上下文明确指出相反，说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一 个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，“一种药物载体”包括两种或多种这类 载体的混合物等。本文中范围可以表示为从“大约” 一个具体的数值，和/或至“大约”另一个具体 的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从所述一个具体数值和/或至所述另 一个具体数值。类似地，当通过在前面使用“大约”将数值表示为近似值时，应当理解的是， 该具体的数值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另一个端 点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此处公开了许多数值，且除 了数值本身外每一个数值在此还以“大约”该具体数值公开。例如，如果公开了数值“10”， 那么也公开了 “大约10”。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了 “小于或等于 该数值”，“大于或等于该数值”以及数值间可能的范围，这正如本领域技术人员所恰当理解 的。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还 应理解，在整个本申请中，以多种不同格式提供数据，这些数据代表了端点和起点，以及这 些数据点任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“ 10”和特定数据点“ 15”，应该理 解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之间的数值也认为已 经被公开。还应理解的是，两个具体单位之间的每个单位也被公开。例如，若公开了 10和 15，那么也公开了 11、12、13和14。“降低”或其他形式的降低指的是减少某一事件或特征。应理解的是，这通常与某 些标准或预期数值相关，换言之它是相对而言的，但是待指代的标准或相关数值通常并不 是必需的。例如，“降低总脂质组合物中的脂肪酸浓度”指的是相对于标准或对照，减少产油 微生物内总脂质组合物中的脂肪酸浓度的量。应理解的是，除非特别指明，否则某一化合物 或组合物或病症可相对于另一化合物或组合物或病症有所降低。“升高”或其他形式的升高指的是增加某一事件或特征。应理解的是，这通常与某 些标准或预期数值相关，换言之它是相对而言的，但是待指代的标准或相关数值通常并不 是必需的。例如，“升高总脂质组合物中的脂肪酸浓度”指的是相对于标准或对照增加产油 微生物内总脂质组合物中的脂肪酸浓度的量。应理解的是，除非特别指明，否则某一化合物 或组合物或病症可相对于另一化合物或组合物或病症有所升高。“抑制”或其他形式的抑制意味着阻止或限制某一具体特征。应理解的是，这通常 与某些标准或预期数值相关，换言之它是相对而言的，但是待指代的标准或相关数值通常 并不是必需的。例如“抑制去饱和酶”指的是相对于标准或对照阻止、限制酶的去饱和活性 量或导致其无活性。应理解的是，否非特别指明，否则某一化合物或组合物或病症可相对于 另一化合物或组合物或病症被抑制。“阻止”或其他形式的阻止指的是终止某一具体特征或病症。由于阻止通常比例如 降低或抑制更为绝对，因此它并不需要与对照进行比较。本文所使用的某些事物可被降低 但不能被抑制或阻止，但是某些可被降低的事物也可被抑制或阻止。可以理解的是，当使用 降低、抑制或阻止时，若未明确指明，另外两个单词的使用也被明确地公开。因此，若公开了 抑制去饱和酶活性，则也公开了降低和阻止去饱和酶的去饱和酶活性。术语“治疗有效”指的是所使用组合物的量是足以改善某一疾病或障碍的一个或 多个病因或症状的量。这种改善仅需降低或改变，而不必消除。
术语“载体”指的是，就使用意图或目的而言，在与某一化合物或组合物混合时，有 助于所述化合物或组合物的制备、储存、给药、送递、有效性、选择性或任何其他特征或对其 有帮助的化合物、组合物、物质或结构。例如，可对载体进行选择，以将活性成分的任何降解 减少到最小并将受试者体内的任何不良副作用减少到最小。在本说明书的整篇描述和权利要求书中，单词“包括”以及该单词的变化形式如 “包含”和“含有”指的是“包括但不限于”，无意于排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。本文所使用的术语“细胞”还指各个微生物细胞、各个产油微生物细胞或来源于这 类细胞的培养物。“培养物”指的是包含相同或不同类型分离细胞的组合物。术语“代谢产物”指的是在将某一化合物引入生物环境例如患者内时产生的活性 衍生物。在谈及药物组合物和营养组合物时，所使用的术语“稳定”在本领域通常被理解 为在特定储存条件下于指定时期内活性成分的损失少于某一特定量，该量通常为10%。 组合物被认为稳定所要求的时间是与每种产品的用途相关的，并由生产该产品、对其进行 质量控制和检查、将其输送给批发商或直接输送给消费者(此时在其最终使用之前再次进 行保藏)的商业实践规定。包括几个月时间的安全系数在内，药物的最短产品寿命通常为 一年，优选18个月以上。本文所使用的术语“稳定”参照了这些市场真实情况以及在容易 实现的环境条件(例如2°c至8°c的冷藏条件)下储存和运输该产品的能力。说明书和文末的权利要求书中所提及的某一组合物或物品中某一具体元件或组 分的重量份表示所述组合物或物品中该元件或组分与任何其他元件或组分之间的表示为 重量份的重量关系。因此，在含有2重量份组分x和5重量份组分y的化合物中，所存在的 x和y的重量比为2 5，并且不管该化合物中是否还含有其他组分，x和y均以该比率存 在。除非明确指出相反，否则某一组分的重量百分比以含有该组分的制剂或组合物的
总重量为基础。“分离中”和任何形式例如“分离”指的是某物处于可被操作或被进一步纯化的形 式的情形。分离的及其各种同义形式指的是某物当前所处的状态不同于之前所处的状态。 例如，若核糖体rna分子被从生物体取出、被合成或被通过重组方式产生，则它可以是“分 离的”。通常，某一事物的“分离”是相对于其他某物而言的。例如，如本文所述可通过如下 方式分离本文述及的产油微生物例如通过培养产油微生物，使得该产油微生物在不存在 可测量(可检测)量的其他生物体的情况下存活。可以理解的是，除非特别指明，任何所公 开的组合物均可如本文所公开的那样分离。另外，如本文所述由该产油微生物产生的脂质 可分离自该产油微生物的全部的或一部分。“纯化”和任何形式例如“纯化中”指的是某一物质或化合物或组合物所处状态 的同质性比之前的状态更高。可以理解的是，如本文所公开的那样，除非另外指明，某物的 纯度可为至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 %。例如，若某一指定组合物a的纯度为90 %，则这意味着该组合物的90 %为a，而该组合物的10%为一种或多种事物，例如分子、化合物或其他物质。例如，若一种公开的真核微 生物例如产生35% dha,则这可被进一步“纯化”，使得最终的脂质组合物具有90%以上的 dha。除非另外指明，否则纯度可由组合物中组分的相对“重量”确定。可以理解的是，除非 特别指明，否则任一所公开组合物均可如所公开的那样纯化。“任选的”或“任选地”指的是随后描述的事件或情况出现与否均可，并且该叙述包 括其中所述事件或情况出现的情形及其不出现的情形。“引物”为一小类这样的探针它们能支持某类酶操作，并且可与靶核酸杂交，从而 使酶操作能够发生。引物可由本领域可获得的核酸或者核酸衍生物或类似物的任一不干扰 酶操作的组合制备。术语“ ω-3”、“η-3”、“ ω-3”、“ ωη-3”及“n-3系列”是指一个多不饱和脂肪酸家
族，它们在ω-3位置共同具有碳-碳双键。例如，术语“ω-3”表示第一个双键为从碳链末 端甲基端(ω)起的第三个碳_碳键。术语“ ω-6”、“η-6”、“ ω-6”、“ ωη-6”及“η-6系列”是指一个多不饱和脂肪酸家
族，它们在ω-6位置共同具有碳-碳双键。例如，ω-6表示第一个双键为从碳链末端甲基 端(ω)起的第六个碳_碳键。术语“ ω-9”、“η-9”、“ ω-9”、“ ωη-9”及“η-9系列”是指一个多不饱和脂肪酸家
族，它们在ω-9位置共同具有碳-碳双键。例如，ω-9表示第一个双键为从碳链末端甲基 端(ω)起的第九个碳_碳键。所有双键都是顺式构型，即两个氢原子在双键的相同侧。术语“产油微生物”是指能够产生油作为其生物量的一部分的微生物。“产油微生 物”可以是真核生物或原核生物。例如，产油微生物可以是含油生物，即能够积累占它们干 生物量20%以上的油和/或脂肪的生物。产油微生物可以是硅藻、微藻、真菌、细菌、原生生 物、酵母、植物(陆生和海生)或藻。术语“含油生物”是指能够产生超过其干生物量20%的脂肪的任何生物。例如， “含油生物”可以是硅藻、微藻、真菌、细菌、原生生物、酵母、植物(陆生和海生)或藻。术语“酮类胡萝卜素(ketocarotenoid) ”是指含有酮基团的类胡萝卜素。术语“类异戊二烯”或“萜类”是指来自类异戊二烯通路的化合物或任意分子，包 括10碳萜类化合物及其衍生物，例如类胡萝卜素类和叶黄素类。术语“类胡萝卜素”是指由五碳异戊二烯单元缩合而成的多烯主链组成的化 合物。类胡萝卜素可以是无环的，或者以一个(单环)或两个(二环)环端基团结 尾。术语“类胡萝卜素”可包括胡萝卜素类和叶黄素类。“胡萝卜素”是指烃类胡萝卜素 (hydrocarboncarotenoid)。这样的胡萝卜素统称为“叶黄素”，即它们含有一个或多个氧原 子，所述氧原子以羟基官能团、甲氧基官能团、氧代官能团、环氧官能团、羧基官能团或醛官 能团的形式，或者在糖苷、糖苷酯或硫酸酯中。特别适合于本发明的类胡萝卜素为单环类胡 萝卜素和二环类胡萝卜素。术语“酮基”或“酮基团”可互换使用，是指这样的基团，即其中的一个羰基结合有 两个碳原子=r2co (r均不为h)。本文使用的术语“脂肪酸生产拮抗剂”是指脂肪酸亚单元和脂肪酸通路的调节物。本文使用的术语“脂肪酸亚单元”或“脂肪酸亚单元类”是指所公开的产油微生物 生产pufa的代谢途径中涉及的16、18、20、22或24碳脂肪酸。例如，“脂肪酸亚单元类”可以包括如图1中所示的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸。“脂肪酸亚单元”还可指所公开的产油微生物生产pufa的代谢途径中涉及的具有 1、2、3、4、5或6不饱和度的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸。另外的实施方案可包括有或 无不饱和度的奇数碳脂肪酸，例如在海洋生物中发现的15、17、19和21碳脂肪酸。本文使用的术语“脂肪酸通路调节物”是指能够抑制所公开的产油微生物生产 pufa的代谢途径中涉及的一种或多种酶的化合物。这份申请通篇中引用了多篇出版物。这些出版物的公开内容通过援引全文纳入本 申请中，目的在于更为全面地描述本申请所属的现有技术的状况。所公开参考文献还就其 中含有的内容通过援引分别地和具体地纳入本文，所述内容在引用该参考文献的句子中进 行了阐述。公开的不仅是可用于本文公开的方法中的组合物本身，而且是可用于制备所公开 组合物的组分。在本文中公开了这些物质和其他物质，并且可以理解的是，在公开这些物质 的组合、子集、相互作用、群组等时，尽管这些化合物的每种不同的各个和全部的组合和排 列可能并未明确地公开，但每种都在此被特别地考虑和描述。例如，如果公开并讨论了破囊 壶菌科某一具体的种，并且讨论了对包括破囊壶菌科的种在内的多种生物体所进行的多种 修饰，那么除非特别指明相反，否则破囊壶菌科的这些种和可能的修饰的每种和各种组合 和排列均得到特别地考虑。因此，如果公开了一类分子a、b和c，并且还公开了一类分子d、 e和f，同时公开了组合分子的实例a-d，则即使没有每个逐一列举，每个也被单独和共同地 考虑，有意义的组合44、4^-0、8^呼、(-0、^以及c-f被认为公开。同样，这些的 任何子集或组合也被公开。因此，例如，a-e、b-f和c-e的子群也被认为是公开的。这一概 念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和应用所公开组合物的方法中的步骤。因 此，如果有多个可以实施的其他步骤，应当理解的是，所述其他步骤的每一步都可以与所公 开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合一起来进行。b.组合物公开了破囊壶菌目的产油微生物，优选具有产生脂质的能力的破囊壶菌属种或裂 殖壶菌属(schizochytrium)种，所述脂质例如脂肪酸，例如不饱和脂肪酸，如ω-3脂肪酸、 如ω-6脂肪酸和ω-9脂肪酸，如(η_3)系列的二十二碳六烯酸(dha)、二十二碳五烯酸 (dpa)和二十碳五烯酸(epa)、(η-6)系列的dpa和(η_9)系列的棕榈酸和硬脂酸。所公开的产油微生物还可产生抗氧化剂，例如但不限于类胡萝卜素化合物胡萝卜 素(例如β _胡萝卜素)和叶黄素化合物虾青素、玉米黄素、β "隐黄素、角黄素和海胆酮。还公开了产油微生物的分离和生长条件。例如，分别和共同公开了产生所公开脂 质和抗氧化剂的异养生长条件。因此，通过使用所公开的产油微生物，能有效产生(η-3)系 列的dha、epa和dpa及/或(n_6)系列的dpa及/或类胡萝卜素系列的抗氧化剂化合物及 /或叶黄素系列的抗氧化剂化合物，它们可用作或用于营养制品、食品添加剂、药物或工业。公开了含有产油微生物的组合物，所述产油微生物包括破囊壶菌属种(本文公开 的一个实例是0nc-t18菌株，其atcc保藏编号为pta-6245)或由其组成。可以理解的是，还公开了表述为0nc-t18的产油微生物以及分离自所述生物体的 任何克隆、经修饰生物体或基因。所公开的产油微生物具有产生不饱和脂肪酸(如含有 ω-3系列的dha、epa和dpa以及ω-6系列的dpa的脂质)和各种抗氧化剂(如类胡萝卜素、叶黄素和酚类物质)的能力。还公开了产生含所述化合物的生物菌体的方法。进一步公开了利用产油微生物来 制备ω-3、ω-6和类胡萝卜素化合物的方法。还公开了生产微生物来源(或单细胞来源) 的油的方法。另外，公开了由所公开产油微生物和任何子代(经遗传修饰或以其他方式修饰) 所产生的脂肪酸和类胡萝卜素，补充有脂质和抗氧化剂的各种饲料、营养制品、药物和食 品，以及将这些化合物用作各种饲料和食品的添加剂的方法。授权给barclay的美国专利no. 5，130，242公开了一种收集和筛选方法，以分离用 于产生ω-3脂肪酸并具有如下特征的微生物菌株1)能异养生长；2)产生高含量的ω-3 脂肪酸；3)单细胞的；4)产生低含量的标准和ω-6脂肪酸；5)无着色的、白色或无色的细 胞；6)耐热的(如在30°c以上生长的能力)；和7)具有广耐盐性(如在较宽范围盐度但优 选在低盐度下生长的能力)。该‘242专利的公开内容还描述了异养生产具有高浓度ω-3脂肪酸的全细胞或经 提取的微生物产物的方法，所述ω-3脂肪酸随后可用于动物食品或者人食品。该方法使用 了通过该专利公开的收集和筛选方法鉴定的微生物。将这些微生物——破囊壶菌目——在 磨碎的谷物中培养。为提高ω-3脂肪酸的产生，使用低温胁迫(stressing)和高溶解氧，同 时添加抗氧化剂、生长因子、维生素和磷。提取得到的产物含有高浓度的ω-3脂肪酸(如 c20:5w3、c22:5w3 和 c22:6w3)和低浓度的 ω-6 脂肪酸(如 c20 4w6 和 c22 5w6)。具体而 言，c20:5w3与c22:6w3脂肪酸的比率为从1 1至1 30。c22 5w3与c226w3脂肪酸 的比率为从1 12至最低仅为痕量的c22:5w3。同样，该微生物产生以重量计占总脂肪酸 的 0. 6 至 0. 72%的 dha、0 至 5%的 dpa 和 0 至 18. 9%的 epa。barclay的美国专利no. 6，451，567公开了一种用于在含有钠盐(如硫酸钠)的 无氯培养基(<3g/l)中培养破囊壶菌和裂殖壶菌的方法。该无氯培养基所得到的细胞团 大小小于150μπι。所公开方法可生产用于水产养殖用食品的微生物和提取物。该食品的 其他组分包括亚麻籽、油菜籽、大豆和鳄梨粉。该微生物每天可产生的ω-3脂肪酸最高为 1. 08g/l培养基。该‘567的公开内容进一步描述了各种培养基，所述培养基包括海水、葡萄 糖(1、3、5或10g/l)、酵母提取物(0. 01,0. 2,0. 4和5g/l)、其他氮源(例如蛋白水解产物 (lg/l)、肝脏提取物(lg/l)、谷氨酸(5g/l)、谷氨酸单钠(msg) (3g/l))和其他盐、痕量维生 素和矿物质(如kh2p04、mgso4和明胶提取物)。yokochi等人的美国专利no. 6，582，941公开了裂殖壶菌属种菌株sr21和属于同 一个种的另一裂殖壶菌菌株，所述种具有产生含高浓度ω-3 dha和/或ω-6 dpa和低浓 度epa的脂肪酸组分的能力。同时，公开了培养这类微生物和分离这类脂肪酸的方法。所 使用的培养基含有海盐、酵母提取物(0. 2、1· 0或10g/l)、玉米浆(0. 5、1· 0或10g/l)、葡萄 糖(10-120g/l)和其他盐(例如nh40ac、磷酸盐)。该脂肪酸组合物含有的dha以重量计 占生物量的约15至20% (以重量计占总脂肪酸的约28% )。该组合物可用于食品(如婴 儿牛奶)中。bailey等人的美国专利no. 6，607，900公开了一种用于培养真核微生物(如裂 殖壶菌种atcc no. 20888)的方法，所述真核微生物能产生的多不饱和脂质(尤其是ω-3 和-6脂肪酸)占其生物量的至少20%。该方法包括在含碳源和氮源的培养基中培养该微生物。还公开了使用低溶解氧水平(小于3%)和低氯离子水平(小于3g/l)来提高产量。 该微生物具有的脂质产量为至少0. 5g/l/h。脂质组分为以重量计占生物量的15%至20% (以重量计占总脂肪酸甲酯的约35% )的dha。komazawa等人的美国专利申请公开文本no. 2004/0161831公开了具有产生dha 的能力的破囊壶菌菌株(lef1,日本 institute ofbioscience and human-technology agency of industrial science andtechnology 的编号为!7erm bp-08568)。通过在常规 培养基中培养，该微生物可产生具有以重量计至少50% dha的油脂。该油脂可由脂肪酶处 理，然后分离dha。该油脂可用于食品或饮品中，或者可水解dha来产生山酸。1.脂肪酸脂肪酸是以末端带有羧基基团的烃链，如果它们含有至少一个碳碳双键则被称为 不饱和的，而在它们含有多个这样的键时则被称为多不饱和的。由于这些双键的位置，长链 多不饱和脂肪酸(pufa)或高度不饱和脂肪酸(hufa)可被分为(n-3)和(n_6)系列。大量 科学证据表明，(n-3)高度不饱和脂肪酸例如dha对心血管疾病、慢性炎症和脑障碍有积极 作用。另一方面，(n-6)脂肪酸被认为是二十酸类固醇例如前列腺素、白三烯等的中间代谢 产物。多不饱和脂肪酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳-碳双键和/或碳-碳三 键。例如，多不饱和脂肪酸可包含3-8、4-7或5-6个碳-碳双键和/或碳-碳三键。目前，这些高度不饱和脂肪酸的主要来源是鱼，已注意到多种鱼种类(例如沙丁 鱼(sardine)、鍉鱼(anchovy)、沙丁鱼(pilchard)和鲔鱼)体内的epa和dha的量分别为 约20%和10%。然而，若要使用鱼油作为这些脂质的唯一来源尚存在一些缺点，例如串味、 在利用度方面存在不可控的波动、天然鱼油含量存在差异以及如果处理不正确可能累积有 害环境污染物等问题。另外，若想从所述来源获得高度纯化的(n-3)或(n-6)油，不通过大 量处理而优先分离和纯化所需的油脂是非常困难的。具体而言，高浓度形式dha在新生儿 补品市场上有很好的前景。若鱼油为所述产品的来源，那么不得不优先地从epa中大量分 离dha。很显然的是，需要这些高度不饱和脂肪酸的高度纯化的且适合生产/或客户的来源 的替代来源。一种这样的来源是使用脂肪酸生产拮抗剂，该拮抗剂直接作用于脂质代谢通 路或者那些与脂肪酸生产有关的通路，例如类胡萝卜素通路，由于类胡萝卜素在产油微生 物中的抗氧化剂性质使得该通路与脂质平行产生。shirasaka 等人(2005)的 mycoscience 46 :358_363 使用氰钴胺素 (cyanocobalamin)和对甲基苯甲酸来改良裂殖壶菌(schizochytriumlimacinum) sr21的 脂肪酸组合物，在氰钴胺素(维生素b12的活性成分)的情况下该改良通过向上调节负 责将丙酸转化成琥珀酸的依赖于钴胺素的甲基丙二酰辅酶a变位酶(methylmanoyl-coa mutase)；以及在添加对甲基苯甲酸的情况下，通过剂量依赖的方式降低ω-6 dpa浓度及 升高epa浓度。除了鱼油之外，各种微生物(主要是海产的)能产生和/或积累(n-3)系 列的二十二碳六烯酸。特别有意义的是这样一个事实微生物生产不会受制于由 外界变化例如季节、天气和食品供应引起的波动。例如，已知以下产油微生物具有 产生dha的能力来自深海的细菌海产弧菌(vibrio marinus) (atcc 15381)、弧菌 种(vibrio sp.)t3615、深海细菌(photobacterium profundum)ss9、海洋被孢霉(mortierellamarina)mp-i 禾口 psychromonas kaikoae (atcc baa—363t)；微藻种例如寇氏 隐甲藻(crypthecodinium cohnii)、隐秘、小环藻(cyclotellacryptica)禾口高山被抱霄 (mortieralla alpina) (1s-4)；以及原生生物破囊壶菌属种(atcc 20892)、金黄破囊壶菌 (thraustochytriumaureum) (atcc 34304)禾口粉红破囊壶菌(thraustochytrium roseum)。 但是，根据一种利用这些经纯化的生物体的方法，每克生物量/每升产生的花生四烯酸、 二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的量较低，介于10至500mg之间。一些实例和代表性的产 生微生物油的生物体示出于图5。已表明ω3脂肪酸具有有益效果，并且本文所公开的油和组合物可就其以下 作用而得以应用对囊性纤维化病(cochrane databasesyst rev. 3)、类风湿性关节炎 (drugs 63 :845-53)、哮喘(ann allergyasthma immunol 90:371-7)和血栓形成性中 风(prev cardiol 6 :38_1)、心脏保护方面的消炎作用；以及对动脉粥样硬化和心律失 常(prostaglandins leukot essent fatty acids. 63 351-62)的直接作用；在乳腺癌 细胞系和前列腺癌细胞系中癌增殖的抑制和在动物实验中减少癌细胞(am j clin nutr 77:532-43)；对精神分裂症(jneural transm suppl 64:105-17)和其他精神病(can j psychiatry48 195-203)的抗紧张作用；可用于正常新生儿发育并用于治疗新生儿感染 (eur j pediatr 162 :122_8)的免疫营养补充剂；并且它可通过直接减弱引起神经性疼 痛和炎性疼痛的神经元病变和神经节病变用于治疗病理性疼痛(prostaglandins leukot essent fatty acids68 :219_24)。2.破囊壶菌科a) onc-t18产油微生物的一个实例为海洋微生物0nc-t18。本文所公开的海洋微生物 0nc-t18是作为产生pufa的微生物分离群体(trip)的一部分而被收集的，从该群体中分离 了 60种以上的纯培养物(详见表7)。另外，从加拿大新斯科舍芬迪湾阿德沃基特港地区 的盐沼草叶片中也分离到了 0nc-t18。通过显微检查、系列培养纯化技术和dna测序技术， 该菌株被发现是属于破囊壶菌属的单体微生物。所有菌株和两个atcc比较培养物(atcc 20891&mya-1381)均在含0. 5%葡萄糖、0. 2%蛋白胨、0. 2%酵母提取物的海水(sw)中生 长，并进行气相色谱(脂肪酸甲酯，fame)分析。图6示出0nc-t18和盘根足虫目(labyrinthulida)其他成员之间推定的系统分 支树图，该系统分支树图是基于通过使用高度保守18s核糖体rna基因获得的序列比较结^ ο图4示出使用邻接法和重复抽样分析技术形成的系统树，其目的是确定0nc-t18 与破囊壶菌科其他成员的关系，该系统树也基于对18s核糖体rna基因直接测序，并使用相 似性矩阵与公众领域中的其他序列比较。使用经典的松树花粉诱集(pine pollen baiting)技术，然后在选择培养基上培 养，最初分离到了 0nc-t18。具体而言，制备含有溶于1升0.2μπι过滤的海水中的5g l—1葡 萄糖、2g l—1蛋白胨、2g l—1酵母提取物的营养培养基。然后使用bligh和dyer提取法以及 pufa气相色谱技术确定0nc-t18的脂肪酸分配比例。色谱结果证实了该菌株产生增加量的 总脂肪酸(tfa)、dha,以及显著量的epa和dpa (包括n_3和n_6脂肪酸)的能力。所公开的产油微生物(包括0nc-t18)可用于一种制备包含dha、epa和dpa的脂质或脂肪的方法中，但所述产油微生物不限于上述0nc-t18或pta-6245菌株，而是包括所述 菌株的任何衍生物，不论该衍生物是否是通过遗传修饰、化学诱变、发酵调节，还是产生所 述菌株的突变体的任何其他方式得到，籍此经这些修饰的产物具有本文公开的遗传特征、 形态特征和/或功能特征，例如产油微生物。公开了能产生具有独特脂质类别特征的脂质组合物的产油微生物，并公开了维持 这类具有相同的高度功能性及其他价值的脂质的稳定、可靠和经济的来源的难题的解决方 案。因此，本文公开了产生更高浓度的(n-3)系列dha和(n-6)系列dpa的野生型菌株，以及 被设计用于产生更高浓度的这些多不饱和脂肪酸的变种和重组菌株。这类变种或重组微生 物包括被设计为具有如下特征的变种和重组菌株在使用相同条件和培养基培养时，它们 具有的所述脂质含量较原始野生型菌株产生的那些脂质含量更高。另外，还包括可筛选被 设计用于具有如下特征的微生物它们与相应野生型菌株相比可产生含有相似量的(n-3) 系列dha、epa和(n-6)系列dpa的脂质，但是所述微生物可有效使用具有更高性价比的底 物。还公开了包含破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中所述产油微生物可产生不 饱和脂肪酸。该多不饱和脂肪酸可为例如ω 3或ω 6脂肪酸，例如dha和dpa。还公开了包含一种或多种破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中当所述产油微 生物在补充了脂肪酸产物拮抗物的情况下生长时，它(们)可产生特定脂肪酸。还公开了包含一种或多种破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中通过在标准发 酵培养基中添加一种或多种脂肪酸生产拮抗剂，所述产油微生物可产生升高量的特定不饱 和脂肪酸，例如ω-脂肪酸，如ερα。在图9及实施例14(c)中阐述了以这种方式使用油酸。公开了含产油微生物的组合物，其中所述组合物可产生脂质。还公开了含一种或多种产油微生物的组合物，其中所述组合物可产生脂质，其中 所述脂质包括本文公开的脂质。还公开了包含一种或多种破囊壶菌目的产油微生物的组合物，其中所述产油微生 物可产生酮类胡萝卜素。酮类胡萝卜素包括，但不限于胡萝卜素和叶黄素，如胡萝卜素 和虾青素。类胡萝卜素是天然存在的脂溶性化合物，从普遍存在的(ubiquitous) c5异戊烯焦 磷酸前体及其结构异构体二甲基丙烯焦磷酸(dimethyallyl pyrophosphate)合成。类胡 萝卜素组成一个丰富的、高度多样的化合物类组。在该化合物类组中存在两类，即烃类胡萝 卜素、胡萝卜素，以及胡萝卜素、叶黄素的氧化衍生物。类胡萝卜素还是地球上的天然化合物的最丰富和多样的类组之一，是我们居住的 世界出现波动的原因。类胡萝卜素通常被用于饲料、食品和营养产业中。它们普遍由光合生 物(包括蓝细菌)产生，但也广泛散布至非光合细菌和真菌中(goodwin，the biochemistry ofcarotenoids. new york :chapman and hall (1980))。虽然类胡萝卜素被分类为次级代 谢产物，但是已知它们对植物生长和光合作用是至关重要的。类胡萝卜素也是许多高等生 物(包括人)必需的，许多的这些高等生物不能合成这些化合物。因此，对许多生物来说， 饮食摄入是类胡萝卜素的唯一来源。其结果是，近年来对类胡萝卜素的饮食来源及实际消 费的研究已经受到了广泛关注。在2006年，全球类胡萝卜素市场据估计价值达9. 547亿美 元，预计到 2010 年这将升至 10. 692 亿美元(carotenoids :a global strategic businessreport, 2006)。饮食中的类胡萝卜素的一个功能是维生素a(视黄素)的前体。显著的维生素a 缺乏会导致儿童可预防的失明，而还会增加患严重感染导致的疾病和死亡的风险(who)。 作为饮食抗氧化剂的类胡萝卜素例如胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素和叶黄 素，具有显著的抗癌活性，并且在慢性病的预防中发挥重要功能(edge，b-biology 4,41, 189-200(1997) ；singh, oncology-new york,12,1643(1998) ；smith, british journal of biomedical science，55，268-275 (1998))。另外，已经将类胡萝卜素消费量的增加与以下 疾病发病的减少关联起来了 退行性疾病，例如老年性黄斑变性(老年失明的主要原因)， 以及某些癌症和慢性心脏病(basu，ja0cs, 78 (7), 665-675 (2001) ；mares-perlmanet al.， j nutr，132(3),518s-524s(2002))。由于类胡萝卜素的共轭双键的主链，它们是有效的生物抗氧化剂，能够吸收施加 于类胡萝卜素链上的单线态氧的激发能，引起所述类胡萝卜素分子的降解，但会阻止其他 分子或组织受到损伤(schagerl andmuller，j plant physiol 2005)。类胡萝卜素可分成 两种结构上不同的类，即胡萝卜素和叶黄素。胡萝卜素具有一个烃主链，而叶黄素包含一个 或多个含氧的官能团(armstrong and hearst, faseb j，10 (2)，228-3 (1996) ；armstrong, annu rev microbiol，51，629-59 (1997))。胡萝卜素是多种生物所共有的，具有高度保守的 生物合成模式。叶黄素与之不同，仅由一小撮(a small clutch of)生物产生。终产物及 合成路线经常是物种特异性的。在类胡萝卜素中，叶黄素获得了最大的关注，特别是胡 萝卜素、角黄素和虾青素。胡萝卜素占领全球市场的最大部分，而角黄素和虾青素分别 [jjigruji)^ 14. 92%^ρ 21. 58% (carotenoids :a global strategic business report, 2006)。叶黄素涵盖多种化合物，例如酮类胡萝卜素、海胆酮和角黄素，通过在β _胡萝卜 素的β-紫罗兰酮环(β-inone ring)位置4和4’分别添加一个或两个羰基而合成。该 反应由统称为β-胡萝卜素酮酶基因的一类基因催化。β-隐黄素(β-crytpoxanthin) 和玉米黄素也被分类为叶黄素，它们是通过用羟基直接置换胡萝卜素的紫罗兰酮 环位置 3 和 3，的氢原子而合成(tian and dellapenna, arch biochem biophys, 430 (1), 22-9(2004))。另外，存在大量的结合了酮化和羟基化的类胡萝卜素，例如3-羟基海胆酮、 3'-羟基海胆酮、金盏花黄质(adonixanthin)和金盏花红素(adonirubin)。虽然本文列出 的所有化合物本身都是具有重要性质的有价值的化合物，但是值得注意的是，它们构成了 生物合成虾青素的重要前体。虾青素是该通路的终产物，在β-胡萝卜素骨架的紫罗兰 酮环3、3’和4、4’碳被羟基化及酮化(ketolated)。而从β -胡萝卜素到虾青素的实际通 路还没有被完全确定，并且可能会被证明是物种特异的(tao et al. ,metab eng. (2006))。还公开了含产油微生物的组合物，其中所述组合物产生抗氧化剂。还公开了组合物，其中所述产油微生物包含破囊壶菌目的成员。还公开了组合物，其中所述产油生物具有的18s核糖体rna基因序列与seq id no 1具有至少80%的同一性。还公开了组合物，其中所述产油生物具有的18s核糖体rna基因序列与genbank 编号为dq374149的序列具有至少80%的同一性。可以理解的是，本文所述产油微生物的任何形式的特征，例如产油微生物的遗传学、脂质特征或分类，均可用于表征本文所公开的产油微生物。产油微生物可包括破囊壶菌 科的一种或多种微生物，它们的实例为atcc编号为20888、20889、20890、20891、20892和 pta-6245的微生物。有很多可使用的、与所述生物体以及它们产生的不饱和脂肪酸或类胡 萝卜素相关的特征。可以理解的是，例如，这些特征可以任何组合或排列形式被用于限定一 个或多个系列的生物体、油或抗氧化剂。例如，一个特征是该生物体自身的类别、该生物体 的遗传学身份、该生物体的脂质和抗氧化剂分配比例，以及该生物体的生长条件。b)类别可用于本文所述方法中的产油微生物可来自网黏菌 门(phylumlabyrinthulomycota)。 所述产油微生物可来自网黏菌纲 (classlabyrinthulomycetes)。所述产油微生物可来自破囊壶菌亚纲(subclass thraustochytridae)。所述产油微生物可来自破囊壶菌目(order thraustochytriales)。 所述产油微生物可来自破囊壶菌科(family thraustochytriaceae)。所述产油微生物可来 自破囊壶菌属(genus thraustochytrium)。所述产油微生物可为破囊壶菌属种。所述产油 微生物可为金黄破囊壶菌(thraustochytrium aureum)。所述产油微生物可为粉红破囊壶 菌(thraustochytrium roseum)。所述产油微生物可为纹状破囊壶菌(thraustochytrium striatum)。产油微生物可为裂殖壶菌属(genus schizochytrium)。所述产油微生物可为 裂殖壶菌属种。所述产油微生物可为任何上面列出产油微生物的修饰形式。所述产油微生 物还可包括所述原核生物纲、亚纲、目、科或属的任何目前未知或分离的成员。产油微生物 的组合可为本文公开的任何产油微生物的任何组合，包括一个或多个破囊壶菌属种、裂殖 壶菌属种、金黄破囊壶菌、纹状破囊壶菌和粉红破囊壶菌。来自破囊壶菌科的产油微生物可为任何上文公开的那些产油微生物。产油微生物 可包括atcc编号为pta-6245的生物。c)遗传学产油微生物可具有18s rrna序列seq id no :1。产油生物可具有genbank编号 dq374149中所述的18s rrna序列。产油微生物可具有与seq id no 1具有约90%的同源 性或本文公开的任何其他同一性的issrrna序列。产油微生物可具有在严格条件或本文公 开的任何其他条件下与seq id no 1或seq id no 1的一部分杂交的18s rrna序列。生物体核酸的序列相似性/同一性和核酸杂交可如本文所述。具体而言，使用 blast (基本的局部比对搜索工具)算法将seq id no 1与在基因组数据库genbank (美 国国家生物技术信息中心，美国国家卫生研究所，贝塞斯达，马里兰，美国)中的核酸序列 相比较，将seqid no :1鉴定为与几个真核破囊壶菌的物种相关(91%相似性)，与破囊壶 菌属种(thraustochytrium sp.) chn-i [ab126669] (94. 5 % 相似性)和破囊壶菌科菌种 (thraustochytriidae sp.)nl-27[ab073308] (95. 5%相似性)密切相关，并且与纹状破囊 壶菌[af265338]最为密切相关(97. 5%相似性)。3.植物脂肪酸生产拮抗剂还可用于影响产油植物中的产油率，所述产油植物包括转基因 物种及天然存在的物种，并且包括代表性作物例如油菜籽、亚麻籽、大豆和向日葵。整合所 述拮抗剂的方法包括，例如对植物周围区域浇水来经根系整合到植物中，作为活性成分添 加到喷雾剂中来直接整合至植物细胞。另外，通过直接浸泡、蒸汽或注射使这些化合物经气孔或皮下进入植物细胞也被认为是有效的方法。4. (1)序列相似性可以理解的是，如本文所述，使用术语同源性和同一性是指与相似性具有相同的 含义。因此，例如若在两个非天然序列之间使用单词同源性，则可以理解的是，这并不一定 指示这两个序列之间的进化关系，而是着眼于其核酸序列之间的相似性或亲缘关系。许多 用于确定两个进化相关分子之间的同源性的方法可以通常适用于任何两个或多个核酸或 蛋白，目的是测量序列相似性，而不管它们在进化上是否相关。—般而言，可以理解的是，确定本文所公开基因和蛋白质的任何已知变体和衍生 物或可能出现的那些变体和衍生物的一种方法是通过用与特定已知序列的同源性来限定 所述变体和衍生物。本文公开的具体序列的这种同一性也在本文其他地方进行了阐述。一 般而言，本文公开的核酸和蛋白质的变体通常与指定序列或天然序列具有至少约50、55、 60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98或99%的同源性。本领域的技术人员容易理解如何确定两个蛋白或核 酸例如基因的同源性。例如，可在将两个序列进行比对之后计算同源性，从而使得同源性处 于最高水平。计算同源性的另一种方法是可通过已公开的算法进行。用于比较的序列的最佳 比对可通过如下方法进行smith和waterman的局部同源性算法(adv. appl. math. 2 :482， 1981)、needleman 和 wunsch 的同源性比对算法(j. mol. biol. 48 :443，1970)、pearson 和 lipman的相似性搜索方法(proc. natl. acad. sci. usa 85 :2444，1988)、这些算法的计算 机化执行(wisconsin genetics 软件包中的 gap、bestfit、fasta 和 tfasta, genetics computer group, 575 seiencedr. , madison, wi)或者核查。核酸的相同类型的同源性可通过用例如在如下文献中公开的算法获得=zuker, μ. science 244 48-52,1989, jaeger et al. proc. natl. acad. sci. usa 86:7706—7710， 1989，jaeger et al. methodsenzymol. 183 :281_306，1989，至少就其与核酸比对相关的内 容通过引用将这些文献纳入本文。可以理解的是，通常可使用任何方法，并且在某些情况 下，这些不同方法的结果可能有所不同，但是本领域的技术人员可以理解，若使用这些方法 中的至少一种方法得到了同一性，则认为该序列具有所述同一性，并在本文中被公开。例如，本文所使用被认为与另一序列具有特定百分比同源性的序列指的是这样一 个序列它具有通过上述任何一种或多种计算方法计算得到的所述同源性。例如，如本文所 定义的，如果使用zuker计算方法计算得到第一个序列与第二个序列具有80%的同源性， 那么即便通过任何其他计算方法计算发现所述第一个序列与所述第二个序列并没有80% 的同源性，所述第一序列与所述第二序列也具有本文所述80%的同源性。作为另一个实 例，如本文所定义的，如果使用zuker计算方法以及pearson和lipman计算方法计算得到 第一个序列与第二个序列具有80%的同源性，那么即便通过smith和waterman计算方法、 needleman和wunscn计算方法、jaeger计算方法或任何其他计算方法计算发现所述第一个 序列与所述第二个序列并没有80%的同源性，所述第一个序列也与所述第二个序列具有本 文所述80%的同源性。作为又一个实例，如本文所定义的，如果使用每一种计算方法均计算 得到第一个序列与第二个序列具有80%的同源性(尽管在实践中不同的计算方法通常会 计算得到不同的同源性百分比)，则所述第一个序列与所述第二个序列具有本文所述80%的同源性。(2)杂交/选择性杂交术语杂交通常指至少两个核酸分子(例如引物或探针与基因)之间的序列驱动 的相互作用。序列驱动的相互作用指的是在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物 之间以核苷酸特异方式出现的相互作用。例如，g与c相互作用或者a与t相互作用就是 序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用出现在核苷酸的watson-crick界面或 hoogsteen界面。两个核酸的杂交受本领域技术人员所知的多个条件和参数的影响。例如， 反应的盐浓度、ph和温度都会影响到两个核酸分子是否会杂交。两个核酸分子之间选择性杂交的参数为本领域技术人员所熟知。例如，在某些实 施方案中，选择性杂交条件可被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格度受控于杂交和 /或洗涤步骤的温度和盐浓度两者。例如，实现选择性杂交的杂交条件可包括在高离子 强度溶液(6xssc或6xsspe)中于较tm(解链温度，在此温度下有一半分子与其杂交伴 侣解离)低约12-25°c的温度下杂交，然后在选定的温度和盐浓度的组合下洗涤，以使得 洗涤温度较tm低约5-20°c。温度和盐条件容易在预实验中通过经验确定，在该预实验中， 固定在滤器上的参照dna样品与目的标记核酸杂交，并随后在不同严格条件下洗涤。对于 dna-rna和rna-rna杂交而言，杂交温度通常较高。如上所述，该条件可用于实现严格度， 或者为本领域已知(sambrook et al. , molecular cloning :a laboratory manual, 2nd ed. , cold springharbor laboratory, cold spring harbor, new york, 1989 ；kunkelet al. methods enzymo 1. 154 :367，1987，至少就其与核酸杂交相关的内容通过援引将其纳入 本文)。dna:dna杂交的优选严格条件为在约68°c (在水溶液中)下于6x ssc或6x sspe 中，然后在68°c下洗涤。如若需要，杂交和洗涤的严格度可随所需互补程度的减少而相应降 低，并且还取决于其中进行任何变异性搜索的区域的g-c或a-t的富集度。同样，如若需要， 杂交和洗涤的严格度可随所需同源性的增加而相应增高，并且还取决于其中任何需要高度 同源性区域的g-c或a-t的富集度，这些均为本领域所知。定义选择性杂交的另一种方法是通过查看一种核酸与另一种核酸结合的量(百 分比)。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是指在至少约60、65、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、 100%的限量核酸与不限量核酸结合时的条件。通常，所述不限量引物为例如10、100或 1000倍过量。这类分析可在如下条件下进行其中限量和不限量引物较其kd低例如10、100 或1000倍，或者其中仅一种核酸分子为10、100或1000倍，或者一种或两种核酸分子高于 其kd。定义选择性杂交的另一种方法是在需要杂交以促进所需酶操作的条件下，查看被 酶操作的引物的百分比。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是在至少约50、55、60、 65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99、100 %的引物在促进酶操作的条件下被酶操作时的条件；例如，若酶操 作是dna延伸，那么选择性杂交条件是在至少约50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物 分子被延伸时的条件。优选的条件还包括制造商所建议的那些条件或者本领域认为适合酶 进行操作的那些条件。
正如同源性的情况一样，可以理解的是，本文公开了多种用于确定两个核酸分子 之间杂交水平的方法。可以理解的是，这些方法和条件可在两个核酸分子之间产生不同的 杂交百分比，但是除非另外指明，否则满足任一方法的参数即可。例如，若需要80%的杂交， 并且只要杂交在这些方法的任一个中出现在所需参数范围内，则认为它被本文所公开。可以理解的是，本领域技术人员明白，若某一组合物或方法一起或单独满足这些 确定杂交的标准中的任一标准，则该组合物或方法即为本文所公开。d)所产生的分子的组合物可以理解的是，本文所公开产油微生物能产生多种化合物和组合物。这些化合物 和组合物可用作识别标志，即一种鉴定产油微生物的方法。例如，表征某一产油微生物的一 种方法是通过该产油微生物产生的脂质分配比例。如本文所公开的，因种种理由，这些不同 的脂质分配比例既可用于进行纯化、操作和收集，又可用以表征该产油微生物。(1)脂质可以理解的是，如本文所公开的那样，每种产油微生物可产生某些不饱和脂肪酸 的分配比例。这些分配比例为该产油微生物的特征。下面为该产油微生物的不饱和脂质分 配比例和其他脂质分配比例的一些实例。例如，产油微生物可产生占干细胞生物量至少约4衬％至6衬％ (如约5wt%) 的脂质或脂肪酸级分，所述脂质或脂肪酸级分包括约owt %至约2衬％的豆蔻酸(如约 1衬％)、约16衬％至约20衬％ (如约18wt%)的棕榈酸、约0wt%至约2wt% (如约lwt%) 的棕榈油酸、约4wt%至约8wt% (如约6wt%)的硬脂酸、约30wt%至约34wt% (如约 32wt%)的油酸、约40wt%至约44wt% (如约42wt%)的亚油酸和约0wt%至约3wt% (如 约 2wt% )的 n-3epa。例如，产油微生物还可产生占干细胞生物量至少约1衬％至3wt% (如约 1. 25wt% )的脂质或脂肪酸级分，所述脂质或脂肪酸级分包括约2wt%至约4wt% (如约 3wt%)的豆蔻酸、50wt%至约60wt% (如约55wt%)的棕榈酸、约2wt%至约4wt% (如约 3wt% )的棕榈油酸、约16 丨％至约20wt% (如约18wt% )的硬脂酸、约9 丨％至约13wt% (如约llwt% )的油酸、约1衬％至约3wt% (如约2wt% )的二十碳二烯酸和约6衬％至 约 iowt % (如约 8wt% )的 n-3epa。真核微生物例如0nc-t18可产生占干细胞生物量至少约30wt%、40wt%、50wt%、 60wt%、70%衬％或80衬％ (如约80wt%)的脂质组合物。例如，产油微生物可产生脂质 组合物，所述脂质组合物包含约25%至约40%的ω-3脂肪酸如n-3dha (例如以重量计至 少 15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%^； 60% )、约 0%至约 3%的 ω-3 月旨 肪酸epa(例如以重量计至少或2%)和约4%至约12%的0-6脂肪酸例如11-60 4(例 如以重量计至少4%、5%、6%、7%、8%、9%或10% )。可以理解的是，可以基于该产油微生物能够繁殖的生长条件，对由产油微生物产 生的脂质的组合物进行处理。通过改变本文公开的各个参数可对组合物进行处理，以产生 例如更高的dha、epa或dpa产率。例如，操作不会产生更多的实际克数，但是该操作可产 生更好的dha或dpa与epa和其他所需pufa的比率，从纯化的角度来看，该比率是所需的。 本文还讨论了多种可用于增加dha、epa或dpa产率的条件。可以理解的是，基于该产油微生物能够繁殖的生长培养基组合物，可以对由产油
19微生物产生的脂质的组合物进行操作。通过改变碳源与氮源的比率及类型两者、所使用盐 的化学组成，以及通过添加某些影响脂肪酸产生的化合物，可产生与所选择的鱼油的分配 比例类似的特异脂肪酸分配比例。例如，操作不会产生更多的实际克数，但是该操作可产生 与例如鱼肝油(codliver oil)、鲔鱼油、鲣鱼油(bonito oil)或经典18 12鱼油的tfa 分配比例类似的tfa分配比例。本文公开了这样的一类方法，即通过在产油微生物能够繁殖的生长培养基组合物 中补充一种或多种脂肪酸生产拮抗剂，来改变由该产油微生物产生的脂肪酸比率。可以在 改变或不改变该产油微生物的总脂肪酸含量的情况下改变该脂肪酸比率。例如，可以通过 在产油微生物的培养基中补充脂肪酸生产拮抗剂来增大ω η-3和/或η-6油与ωη-9油 的比率。还公开了这样的一类方法，即通过在产油微生物能够繁殖的生长培养基组合物中 补充一种或多种脂肪酸生产拮抗剂，在不改变该产油微生物的总脂肪酸含量的情况下，改 变由该产油微生物产生的脂肪酸比率。图1示出了由所公开真核微生物产生的各种pufa的一个代谢途径的实例，这与 脂肪酸甲酯代谢产物追踪结果一致。使用例如简并引物研究(metz et al. (2001) science 293 290-3 和 kaulmann&hertweck(2002) angew. chem. int. ed. 41 1866-9)，可在本文所公 开途径中鉴定的蛋白质为聚酮合酶。使用例如杂交探针以及/或者简并引物或靶引物，还 可鉴定延伸酶和去饱和酶。使用例如杂交探针和/或简并引物，还可鉴定脂肪酸合酶。5.生长和培养进行了包括碳、氮(肽氮)、磷和硫、渗压剂和ph在内的表型微孔板(phenotypic microplate)石if究。正交阵列(taguchi)法用于确定最佳培养基组成和氮、碳和盐浓度的变化 (jos印h j&piganatiells jr(1998)iie trans，20 247-254)。在发酵0nc-18的时候，发现若增加搅拌或d02，则会增加生物菌体产量和tfa，但 减少dha。若减少搅拌或d02，则会减少细胞生物量(g)，并减少tfa，但增加dha，而且也会 减少 c16:0、c16:1 和 c18:l。若升高温度，则会增加生物菌体产量和tfa，但减少dha。若降低温度，则会减少细 胞生物菌体(g)，并减少tfa，但增加dha，而且会减少c16 0、c16 1和c18 1。来源于所公开产油微生物的细胞生物菌体可通过接种合适的天然或人工海水培 养基(含约2%至约100%的海水)获得。该产油微生物能利用该培养基中的各种营养组 分。在该培养基中所使用的碳源的实例为糖类例如葡萄糖、果糖、右旋糖(dextrose)、乳果 糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)，以及糖衍生物如醋酸 盐、m-肌醇(来源于玉米浆)、半乳糖醛酸(来源于果胶)、l-岩藻糖(来源于半乳糖)、龙 胆二糖、葡糖胺、α-d-葡萄糖-1-磷酸盐(来源于葡萄糖)、纤维二糖(来源于纤维素)、糊 精(来源于玉米)和α-环糊精(来源于淀粉)，和多元醇例如麦芽糖醇、赤藻糖醇、侧金盏 糖醇，和油酸例如甘油和吐温80 (tween 80)，和氨基糖例如n-乙酰基-d-半乳糖胺、n-乙 酰基-d-葡糖胺和n-乙酰基-β-d-甘露糖胺。而氮源的实例为天然氮源如蛋白胨、酵母 提取物、麦芽提取物和鱼粉，或者为有机氮源例如谷氨酸钠，但不限于此。另外，如若必要， 磷酸盐例如磷酸钾和磷酸钠、无机盐例如硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚
20硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰和氯化钙可仅与螯合化合物乙二胺 四乙酸一起单独用作微量养分，或者与该螯合剂以及维生素例如盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、 泛酸钙、对氨苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素b12—起用作微量养分。在配制好 培养基后，使用酸或碱将ph调节至3. 0至10. 0之间，合适地，调节至例如ph4. 0至6. 5之 间，并且通过例如高压灭菌对培养基进行灭菌。在温度为4至30°c、优选18至28°c下，通 过通气振荡培养、振荡培养、静止培养、分批培养、连续培养、滚动分批培养或波动培养等， 将培养进行1至30天、1至21天、1至15天、1至12天、1至9天或优选3至5天。以下的条件是可产生一系列脂质的条件的实例，所述脂质的产量使得它们可用作 商品。对0nc-t18的培养条件的研究表明，本文所公开的产油微生物在天然或人工海水或 者在含有浓度最低至5%的天然或人工海水的培养基中生长良好。加入该培养基中的碳源 和氮源可为上文所述的通常使用的那些碳源和氮源。天然氮源或有机氮源相对而言是等效 的，并且该培养基中的总氮浓度保持恒定。将这些碳源或氮源以标准浓度加入培养基中。如 本文所公开的那样，若满足这些条件，则对脂质含量、累积的dha、dpa和epa的比例或量几 乎没有影响。对于0nc-t18的高浓度发酵而言，能够使用几种方法来增加细胞生物量和脂质产 率。这些方法包括分别将培养基中碳和氮两者的浓度(两者的比率为6 1至15 1之 间，优选6 1至13 1之间；温度为4至30°c之间，优选18至28°c之间)从5g厂1至 60g γ1 升高至 ioog l—1 至 160g γ1，和从 4g l—1 至 iog γ1 升高至 40g l—1 至 60g γ1。使 用这种方法，所产生的生物量和脂质的比例也以相当的比例增加。另外，通过将碳源从5g γ1至60g γ1升高至ioog l—1至160g l—1而氮源保持不变，可以增加脂质产量。另外，通过 将氮源的量从iogl4升高至60g γ1而碳源保持不变，可以增加生物菌体产量，同时维持脂 质含量。此外，实验表明生物量和脂质产量随搅拌的加快(范围在100至iooorpm之间，更 好地在350至600rpm之间，并且最佳地在350至450rpm之间)而大大提高，并且脂质含量 仅有最低限度的降低，脂肪酸分配比例没有减少，并且搅拌在异养发酵早期特别有用。实验 还表明，在这些微生物的经典补料分批发酵的脂质积聚阶段，培养基中的溶解氧含量介于1 至10%之间、最好是在5%时，可得到最适宜的脂质产量(见图8)。最后，将乙酸盐、微量元 素、金属和维生素加至所述生产培养基(如上所述)中可增加dha、epa和dpa相对于其他 脂肪酸的产量，而不降低总脂质值。通过进行上述异养发酵，能持续产生细胞生物量，所述细胞生物量可产生含(n-3) 系列dha的脂质，所述dha在培养基的浓度较高，不低于5g/升培养基、更优选不低于20g/ 升培养基(见图8)。另外，实验表明，在达到最大生物量水平之后，这些脂质中有大部分在 培养的对数晚期/过渡期期间累积。然而，在发酵过程中，脂质含量通常不会低于总生物量 的25%，通常最大为约80%。可使用常规搅拌发酵罐进行上述条件下的培养。还可使用泡 罩塔发酵罐(成批培养或连续培养)或波动发酵罐。可使用各种常规方法例如离心(如离心式固液分离机(solid-ejecting centrifuge))或过滤(例如交叉流过滤)来在进行脂质分离之前收集细胞生物量，并且所 述方法还可能会包括使用用于加速细胞生物量收集的沉淀剂(例如磷酸钠、氯化钙或聚丙 烯酰胺(polyacridamide))。a)脂肪酸生产拮抗剂
用于培养所公开的产油微生物的培养基还可包含脂肪酸产生的拮抗剂。脂肪酸 生产拮抗剂可以是脂肪酸亚单元或脂肪酸通路调节剂。例如，脂肪酸生产拮抗剂包括，但 不限于油酸、浅蓝菌素、甲基苯甲酸、姜黄素、环丙烯、没食子酸烷基酯、没食子酸丙酯、芝麻 油、花生油、菜籽油、哒嗪酮、氟草敏(norxlurazon)、二苯胺、稀禾定(sethoxydim)和辣椒 素(capsaicin)。本文使用的术语“脂肪酸亚单元”或“脂肪酸亚单元类”是指这样的16、18、20、22 或24碳脂肪酸，即它们参与所公开的产油微生物的用于产生pufa的代谢途径。例如，“脂 肪酸亚单元”可包括图1中所示的任意16、18、20、22或24碳脂肪酸。“脂肪酸亚单元”用于本文中还可指这样的具有1、2、3、4、5或6个不饱和度的任意 16、18、20、22或24碳脂肪酸，即它们参与所公开的产油微生物的用于产生pufa的代谢途 径。另外的实施方案可包括奇数碳的具有或不具有不饱和度的脂肪酸，例如海洋生物中发 现的15、17、19和21碳脂肪酸。脂肪酸途经调节剂可以是这样的化合物，即它们能够抑制参与所公开的产油微生 物的用于产生pufa的代谢途径的一种或多种酶。除非另外指出，参与所公开的产油微生物 的用于产生pufa的代谢途径的一种或多种酶的抑制可以是抑制至少50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。脂肪酸途经调节剂可以是这样的化合物，即它们能够抑制参与所公开的产油微生 物的用于产生pufa的代谢途径的一种或多种去饱和酶或延长酶。脂肪酸途经调节剂还 可以是能够抑制所公开的产油微生物的八氢番茄红素去饱和酶(phytone desaturase), β -胡萝卜素c4-加氧酶、脂肪酸合酶或乙酰辅酶a羧化酶的化合物。6.脂质的分离图2示出所公开的产油微生物的一般脂肪酸分配比例。图5-7示出摇瓶中生物量 (g/l)、脂质(tfa)和dha含量(均mg/g生物量)为以下发酵条件的函数，即单独的或者存 在l-谷氨酸或酵母提取物(ye)情况下的各种氮源、碳源(单独地)或补充(即除了本文 全文中提及的氮源和碳源之外)各种抗氧剂、植物激素或简单碳源的培养物。所有这些数 据均可用于提取所公开的产油微生物的特异特征。含有(n-3)系列dha、dpa和epa以及(n_6)系列dpa的脂肪可通过如下步骤获得 例如通过碾磨、超声处理来破坏或破裂收集到的细胞生物菌体，然后使用溶剂例如氯仿、己 烷、甲醇、乙醇或通过超临界流体抽提方式进行提取。所得到的含(n-3)系列dha和(n-6) 系列dpa的脂肪的含量为在每克干细胞生物量优选高于0. 25g，更优选高于0. 6g。所公开的产油微生物(包括产油微生物0nc-t18)能产生如上述获得的脂质，该真 核微生物的任意变种以及其同种成员之间的任意结合可以产生具有如下分配比例的脂质。 中性脂质的百分比以重量计为总脂质的至少95%。例如，0nc-t18产生的中性脂质中脂肪 酸的典型组成如下15%的豆蔻酸、8%的十五酸、35%的棕榈酸、7%的棕榈油酸、1 %的硬 脂酸、2%的油酸、1 %的二十碳五烯酸、6%的二十二碳五烯酸和25%的二十二碳六烯酸。在 培养基中补充一种或多种脂肪酸生产拮抗剂时，可增大ωη-3和ωη-6油例(如二十二碳 六烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸(n-3和n-6两者))与ωη-9油(例如硬脂酸) 的总比率。例如，图11示出与培养基中没有添加脂肪酸生产拮抗剂的对照相比，ωη-3和ωη-6油的比率的可能变化。其他实施例可以参见图12-15。所公开的产油微生物(例如0nc-t18)能产生如上述获得的脂质，该真核微生物的 任意变种以及其同种成员之间的任意结合可以产生具有如下分配比例的脂质。0nc-t18的 中性脂质级分中甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的百分比分别为0%至约2%、0至约2%和 96至约100%。而占脂质级分5%至约10%的极性脂质级分包括与中性脂质结合和未与之 结合的磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸(phosphotidic acid)。可以理解的是，这些脂质可以任何组合或排列存在于这些生物体内。还可以理解 的是，这些脂质的浓度可通过改变如上所述的生长条件以及培养基条件和组成来操控。(1)脂质浓度所公开的产油微生物可产生含大于等于约4. og l—1培养基的n-3dha、epa和n-6 dpa的脂质级分。所公开的产油微生物可产生含大于等于约20. og l—1培养基的n-3 dha, epa和n-6 dpa的脂质组合物。所公开的产油微生物可产生含大于等于约14. og l—1培养 基的n-3 dha、epa和n-6 dpa的脂质组合物。所公开的产油微生物可产生约1. 5g l—1至约 5. og γ1 (如约 4. 6g γ1)的 n-3 dha、约 0. 5g l-1 至约 1. 5gl_1 (如约 0. 22g l-1)的 n-3 epa 和约0. 5g l—1至约1. 5g l—1的n-6dpa。另外，所公开的产油微生物可产生含有介于301. 2 至360. 3mg/g细胞生物量甚至最高达790mgg细胞生物量的如下物质的脂质级分豆蔻酸、 肉豆蔻稀酸、十五酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、 二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。所公开的产油微生物还可产生含有如 下物质的级分44. 3至57mg 的豆蔻酸(等于1134. 5至1458. img γ1)、0· 5至0. 65mg g—1的肉豆蔻稀酸(等于13. 3至16. 63mg l-1)、33· 5至34. 6mg g-1的十五酸(等于856. 9 至 885. img 厂o、121. 9 至 165. img 的棕榈酸(等于 3118. 2 至 4223. 3mg γ1)、7· 9 至 28. 5mg g-1的棕榈油酸(等于202. 1至729mg l-1)、4· 38至5. 9mg g-1的硬脂酸(等于112 至 15img γ1)、6· 94 至 9. 9mg 的油酸(等于 177. 5 至 253. 2mg γ1)、0· 4 至 1. 3mg 的 亚油酸(等于11. 26至33. smgl-1)、0· 5至1. omg g4的二十碳二烯酸(等于12. 8至25. 6mg l-1)、0· 4至0. 5mg g-1的花生四烯酸(等于10. 2至13mg l-1)、75至ioomgg"1的二十二碳 六烯酸(等于1918至2560mg γ1)、1· 9至6mg g"1的二十碳五烯酸(等于48. 6至153. 5mg l-1)和17. 1至33. 7mg g-1的二十二碳五烯酸(等于437. 4至862. img l-1)，细胞生物量内 总脂肪酸含量介于301至790mg g-1之间(等于7700至20，209mg l-1)。总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂稀禾定的存在可改变脂肪酸 组成，例如11. 27%至10. 97%豆蔻酸、0. 23%至0. 03%肉豆蔻稀酸、3. 92%至5. 5%十五 酸、0. 43% 至 0. 53% 顺十五碳烯酸(pentadecenoic acid) ,45. 57 % 至 40. 52% 棕榈酸、 11. 63%至9. 18%棕榈油酸、1. 16%至1. 49%十七烷酸、1. 84%至1.45%硬脂酸、0. 00%至 0. 18%油酸、2. 89%至2. 48%异油酸、0. 36%至0. 2%花生酸、0. 12%至0. 00%二十碳烯 酸、0. 38%至0. 14%二十碳二烯酸、0. 14%至0. 10%高-γ -亚麻酸、0. 13%至0. 20%花生 四烯酸、余量0. 00%二十碳三烯酸、0. 26%至0. 37%二十碳四烯酸、0. 38%至0. 78%二十 碳五烯酸、余量0. 00%山酸、1. 12%至1. 09%二i^一碳五烯酸、0. 20%至0. 00%二十二碳 二烯酸、0. 16%至0. 00%肾上腺酸、3. 88%至5. 26%二十二碳五烯酸n_6、0. 35%至0. 24% 二十二碳五烯酸n-3、余量0. 00%木蜡酸、13. 54%至19. 31 %二十二碳六烯酸、余量0. 00% 神经酸以及0. 27%至0. 20%二十六烷酸。
总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂浅蓝菌素的存在可改变脂肪 酸组成，例如11. 10%至11. 03%豆蔻酸、余量0. 00%肉豆蔻稀酸、3. 84%至3. 23%十五 酸、0. 11%至0. 10%顺十五碳烯酸、50. 52%至48. 98 %棕榈酸、1. 93 %至2. 22%棕榈油 酸、0. 85%至0. 74%十七烷酸、1. 55%至1. 86%硬脂酸、0. 13%至0. 29%油酸、0. 93%至 1. 24%异油酸、0. 38%至0. 41%花生酸、0. 00%至0. 19%二十碳烯酸、余量0. 17%二十碳 二烯酸、0. 15%至0. 20%高-γ -亚麻酸、0. 16%至0. 30%花生四烯酸、余量0. 00%二十碳 三烯酸、0. 34%至0. 36%二十碳四烯酸、0. 72%至1. 17%二十碳五烯酸、0. 10%至0. 11% 山酸、1.27%至1.24%二i^一碳五烯酸、0. 13%至0. 14%二十二碳二烯酸、余量0. 00%肾 上腺酸、5. 47%至5. 83% 二十二碳五烯酸n-6、0. 16%至0. 23 % 二十二碳五烯酸n_3、余 量0. 00%木蜡酸、19. 98%至19. 97%二十二碳六烯酸、余量0. 00%神经酸以及0. 16%至 0. 23%二十六烷酸。总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂油酸的存在可改变脂肪酸组 成，例如24. 46%至1. 38%豆蔻酸、0. 03%至0. 00%肉豆蔻稀酸、2. 43%至0. 49%十五酸、 余量0. 00%顺十五碳烯酸、42. 82%至16. 67%棕榈酸、0. 46%至1. 06%棕榈油酸、0. 31% 至0. 28%十七烷酸、1. 26%至1. 56%硬脂酸、0. 15%至25. 36%油酸、0. 26%至2. 68%异 油酸、0. 36%至0. 00%花生酸、余量0. 00%二十碳烯酸、0. 06%至0. 51%二十碳二烯酸、 0. 13%至0. 61%高-γ -亚麻酸、0. 22%至0. 72%花生四烯酸、余量0. 00%二十碳三烯酸、
0.27 %至0. 00 % 二十碳四烯酸、0. 62 %至5. 47 % 二十碳五烯酸、0. 10 %至0. 00 %山酸、
1.01%至 0. 20%二i^一碳五烯酸、0. 14%至 0. 68%二十二碳二烯酸、0. 14%至 0. 60% 肾 上腺酸、5. 85%至7. 58%二十二碳五烯酸n-6、0. 14%至0. 39%二十二碳五烯酸n_3、余量 0. 00%木蜡酸、18. 77%至33. 16%二十二碳六烯酸、余量0. 00%神经酸以及余量0. 00% 二十六烷酸。总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂油酸与葡萄糖酶(glucoase) 的存在可改变脂肪酸组成，例如24. 46%至8. 04%豆蔻酸、0. 03%至0. 00%肉豆蔻稀酸、
2.43%至0. 73%十五酸、余量0. 00%顺十五碳烯酸、42. 82%至33. 18%棕榈酸、0. 46%至 4. 22%棕榈油酸、0.31%至0. 17%十七烷酸、1. 26%至1.60%硬脂酸、0. 15%至9. 49%油 酸、0. 26%至4. 45%异油酸、0. 36%至0. 34%花生酸、0. 00%至0. 30%二十碳烯酸、0. 06% 至0. 36%二十碳二烯酸、0. 13%至0. 30%高- γ-亚麻酸、0. 22%至0. 46%花生四烯酸、 余量0. 00% 二十碳三烯酸、0. 27%至0. 24% 二十碳四烯酸、0. 62%至2. 60% 二十碳五烯 酸、0. 10%至 0. 00% 山酸、1. 01%至 0. 79%二i^一碳五烯酸、0. 14%至 0. 43%二十二碳二 烯酸、0. 14%至0. 28%肾上腺酸、5. 85%至6. 46% 二十二碳五烯酸n_6、0. 14%至0. 39% 二十二碳五烯酸n-3、余量0. 00%木蜡酸、18. 77%至24. 65%二十二碳六烯酸、余量0. 00% 神经酸以及0. 00%二十六烷酸。总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂辣椒素的存在可改变脂肪酸 组成，例如9. 7%至21. 86%豆蔻酸、0. 00%至0. 28%肉豆蔻稀酸、9. 83%至0.91%十五 酸、0. 11%至0. 23%顺十五碳烯酸、43. 48%至24. 19 %棕榈酸、1. 52 %至17. 98%棕榈油 酸、2. 29%至0. 19%十七烷酸、1. 59%至1.60%硬脂酸、0. 10%至0. 00%油酸、1.27%至 6. 67%异油酸、0. 26%至0. 20%花生酸、余量0. 00% 二十碳烯酸、0. 03 %至0. 23% 二十 碳二烯酸、0. 25 %至0. 22 %高-γ -亚麻酸、0. 17 %至0. 78 %花生四烯酸、余量0. 00 %二十碳三烯酸、0. 30%至0. 27%二十碳四烯酸、0. 48%至1. 38%二十碳五烯酸、0. 08%至 0. 00% 山酸、0. 00%至 0. 00%二i^一碳五烯酸、0. 13%至 0. 17%二十二碳二烯酸、0. 07% 至0. 46%肾上腺酸、6. 53%至5. 19%二十二碳五烯酸n_6、0. 22%至0. 31%二十二碳五烯 酸n-3、余量0. 00%木蜡酸、21. 48%至16. 86%二十二碳六烯酸、余量0. 00%神经酸以及余 量0. 00%二十六烷酸。总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂甲基苯甲酸的存在可改变脂 肪酸组成，例如8. 95%至11. 19%豆蔻酸、余量0. 00%肉豆蔻稀酸、9. 79%至14. 93%十五 酸、0. 13%至0. 27%顺十五碳烯酸、32. 80%至26. 90 %棕榈酸、1. 94 %至2. 36%棕榈油 酸、1.89%至2. 69%十七烷酸、1. 28%至1. 59%硬脂酸、0. 10%至0. 11%油酸、1.64%至 3. 68%异油酸、0. 22%至0. 23%花生酸、0. 01%至0. 14% 二十碳烯酸、0. 20%至0. 79% 二十碳二烯酸、0. 12%至0. 17%高- γ-亚麻酸、0. 38%至0. 90 %花生四烯酸、0. 08%至 0. 03% 二十碳三烯酸、0. 38%至0. 36% 二十碳四烯酸、1. 16%至2. 95% 二十碳五烯酸、 余量0. 00%山酸、0. 43%至0. 39%二i^一碳五烯酸、0. 09%至0. 06%二十二碳二烯酸、 0. 19%至0. 46%肾上腺酸、9. 43%至5. 95%二十二碳五烯酸n_6、0. 27%至0. 54%二十二 碳五烯酸n-3、0. 07 %至0. 03 %木蜡酸、28. 48 %至23. 03 % 二十二碳六烯酸、0. 03 %至 0. 18%神经酸以及余量0. 00%二十六烷酸。总脂肪酸的百分比形式的脂质脂肪酸生产拮抗剂氟草敏的存在可改变脂肪酸 组成，例如12. 36%至11. 08%豆蔻酸、余量0. 12%肉豆蔻稀酸、2. 71%至3. 16%十五酸、 0. 35%至0. 33%顺十五碳烯酸、43. 24 %至40. 61 %棕榈酸、15. 54 %至10. 65%棕榈油 酸、0. 80%至1. 03%十七烷酸、1. 61%至1. 52%硬脂酸、0. 04%至0. 00%油酸、3. 22%至 3. 53%异油酸、0. 23%至0. 16%花生酸、0. 00%至0. 02%二十碳烯酸、0. 15%至0. 13% 二十碳二烯酸、0. 11%至0. 18%高-y-亚麻酸、0. 14%至0. 19%花生四烯酸、余量0. 00% 二十碳三烯酸、0. 13%至0. 24% 二十碳四烯酸、0. 52%至0. 76 % 二十碳五烯酸、0. 07% 至0. 05%山酸、余量0. 00%二i^一碳五烯酸、0. 11%至0. 03%二十二碳二烯酸、0. 23%至 0. 17%肾上腺酸、3. 98%至5. 23%二十二碳五烯酸n-6、0. 13%至0. 19%二十二碳五烯酸 n-3、0. 09%至0. 00%木蜡酸、14. 13%至20. 61 %二十二碳六烯酸、余量0. 00%神经酸以及 余量0. 00%二十六烷酸。(2)其他分子所公开的产油微生物可进一步产生类胡萝卜素和叶黄素。这类类胡萝卜素和叶 黄素的实例包括胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素、芬尼黄质、玉米黄素、海胆酮、 β-隐黄素、辣椒红、黄体素(iutin)、胭脂树橙、脱辅基-8-胡萝卜素醛和脱辅 基-8-胡萝卜素醛-酯。由所公开的产油微生物产生的叶黄素可与同样由所述所公开的产油微生物产生 的各种pufa相缀合。(a)抗氧化剂通常，抗氧化剂为与氧反应并通常被氧所消耗的化合物。由于抗氧化剂通常与 氧反应，所以抗氧化剂还通常与自由基生成物和自由基反应(“the antioxidants-the nutrients that guard your body" byrichard a. passwater, ph.d. ,1985, keats publishing inc.，至少就其与抗氧化剂相关的内容通过援引纳入本文)。所述组合物可
25包含任何抗氧化剂，非限制性实例可包括但不限于可直接清除自由基的非类黄酮抗氧化 剂和营养物，包括综合胡萝卜素(multi-carotene)、β -胡萝卜素、α -胡萝卜素、υ-胡 萝卜素、番茄红素、黄体素和玉米黄素、硒、维生素e(包括α-、β-和y-生育酚，特别 是α “生育酚等)、维生素e的琥珀酸酯和trolox(—种可溶的维生素e类似物)维生素 c (抗坏血酸)和niacin (维生素b3、烟酸和烟酰胺)、维生素a、13_顺式视黄酸、n-乙酰 基-l-半胱氨酸(nac)、抗坏血酸钠、吡咯烷-二硫代-氨基甲酸酯和辅酶qlo ；催化破坏 自由基的酶类，包括过氧化物酶例如作用于h2o2和例如有机过氧化物的谷胱甘肽过氧化物 酶(gshpx)，包括作用于h2o2的过氧化氢酶(cat)、岐化o2h2o2的超氧化物岐化酶(sod)、谷 胱甘肽转移酶(gshtx)、谷胱甘肽还原酶(gr)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)以及它们的 模拟物、类似物和聚合物(抗氧化酶例如sod的类似物和聚合物描述于例如美国专利系列 号no. 5，171，680，至少就其与抗氧化剂和抗氧化酶相关的内容通过援引将其纳入本文)； 谷胱甘肽；血浆铜蓝蛋白；半胱氨酸和半胱胺(β_巯基乙胺)，以及类黄酮和类黄酮样分 子例如叶酸和叶酸盐。抗氧化酶及其模拟物和抗氧化营养物的综述可参见kumar et al, pharmac. ther. 39 301，1988 禾口 machlin l.j. and bendich, fasebjournal 1:441—445， 1987，就其与抗氧化剂相关的内容通过援引将这两篇文献纳入本文。类黄酮也称为“苯并色酮”，为天然存在的、具有抗氧化性的水溶性化合物。类黄酮 广泛分布于维管植物中，并存在于大量蔬菜、水果和饮料如茶和酒(特别是红酒)中。类黄 酮为共轭的芳香族化合物。存在最为广泛的类黄酮是黄酮和黄酮醇(例如杨梅黄酮(3，5， 7，3’，4’，5’，_六羟黄酮)、栎皮黄酮(3，5，7，3’，4’ -五羟黄酮)、山奈黄素(3，5，7，4，-四 羟黄酮)、黄酮芹菜苷配基(5，7，4，-三羟黄酮)、毛地黄黄酮(5，7，3，，4，-四羟黄酮)及 其糖苷和栎皮黄酮)。类胡萝卜素是由多种微生物和植物所产生的重要天然色素，通常为红色、橙色或 黄色。在过去类胡萝卜素已被用于饲料、食品和营养制品产业。已知它们是植物生长和光 合作用所必需的，并且为人体内维生素a的主要膳食来源。膳食性抗氧化剂例如类胡萝卜 素(β_胡萝卜素、番茄红素、虾青素、角黄素、玉米黄素、辣椒红、黄体素、胭脂树橙、脱 辅基-8-胡萝卜素醛和脱辅基-8-胡萝卜素醛-酯)展现出显著的抗癌活性，并且在 慢性疾病的预防中起着重要作用。类胡萝卜素为有效的生物学抗氧化剂，所述类胡萝卜素 可将单线态氧上的激发能吸收到类胡萝卜素链上，从而导致类胡萝卜素分子的降解，但是 可防止其他分子或组织被损害。氧是代谢功能所必需的，但是它也会攻击细胞。人体具有多种从其细胞中除去氧 产生的分子的代谢酶和抗氧化剂。氧化应激被认为是诸多病症的影响因素，所述病症例如 类风湿性关节炎、缺血性心脏病和中风、阿尔茨海默痴呆、癌症和衰老。因此，抗氧化剂具有 预防多种疾病的潜能。已从海洋微生物来源中分离了几种抗氧化剂化合物；这些抗氧化剂 化合物包括虾青素、β "胡萝卜素和其他类胡萝卜素。类胡萝卜素是一组分布广泛的天然存在的色素，有700种以上的主要由微藻、大 藻、细菌和真菌种产生的天然脂溶性色素，并且虾青素及其衍生物在商业上受到特别关注。 虾青素是极其有效的抗氧化保护剂。然而，与胡萝卜素不同，虾青素容易穿过血脑屏障 /血视网膜屏障，因此还具有预防脑病和眼病的潜能。临床前研究证明了服用虾青素的各种 有益效果，例如(i)抑制膀胱、结肠、肝脏、乳腺和口腔中的癌形成和生长；(ii)使眼睛的
26视网膜免受氧化损伤，因此具有抵抗老年黄斑疾病的作用；(iii)促进免疫活性提高；(iv) 提供免于紫外线损伤的保护；以及(v)提供更好的肌耐力。b)微生物的分离公开了通过以下方法所获得的来自破囊壶菌科的微生物，所述方法包括在盐水 (天然海水或人工盐水)中用花粉粒诱集营养体(vegetative)样品并进行培养；分离花粉 粒并将其转移至异养培养基中并进行培养；鉴定产生脂肪酸的分离株，从鉴定得到的分离 株分离来自破囊壶菌科的微生物。其他形式的分离包括添加了合适抗生素的培养基以及通 过如上所述的显微方法或通过使用18s rrna基因引物或探针进行的鉴定。异养培养基可 如下文所述。5.由真核微生物产生的脂质和其他分子公开了脂质组合物，所述脂质组合物包含约25wt%至约40衬％的11-3 dha，约 6wt%至约 10wt%&n-6 dpa 和约(^1%至约 10wt%&n-3 epa。脂质组合物可进一步包含约ilwt %至约15wt% (如约13wt% )的豆蔻酸、约 7wt %至约llwt% (如约9wt% )的十五酸、约37wt %至约41wt% (如约39wt % )的棕榈 酸、约3wt%至约7wt% (如约5wt% )的棕榈油酸、约0至约3wt% (如约iwt % )的硬脂 酸或约1 丨％至约4wt% (如约2wt% )的油酸。脂质组合物可含有浓度大于约400mg生物量的n-3 dha，浓度大于ioomg生物量的 n-6 dpa0脂质组合物还可含有类胡萝卜素。这类类胡萝卜素的实例包括胡萝卜素、番 茄红素、虾青素、玉米黄素、角黄素、海胆酮、芬尼黄质、辣椒红、黄体素、胭脂树橙、β -脱辅 基-8-胡萝卜素醛和β -脱辅基-8-胡萝卜素醛-酯。在一方面，该组合物可含有至少约n-3 dha、约iwt %的n_3 dpa、约 6wt % 的 n-6 dpa 和约 iwt % 的 n-3 epa。7.含有由真核微生物产生的分子的组合物人和动物(包括海生动物)用的食物、补充剂、药物组合物可包含该组合物(脂 质、含抗氧化剂的脂质和抗氧化剂自身)。还公开了包含该组合物(脂质、含抗氧化剂的脂质和抗氧化剂自身)的婴儿配方。c.方法1.脂质制备方法公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括培养包括来自破囊壶菌科的一种 或多种微生物在内的产油微生物，并分离所述脂质组合物。还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异 养培养基中培养所述产油微生物。还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异 养培养基中培养所述产油微生物，还包括分离所述脂质组合物。还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异 养培养基中培养所述产油微生物，其中所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率增 大。还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养所述产油微生物，其中如图11中所示，所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂 肪酸的比率与对照相比有变化。还公开了制备脂质组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异 养培养基中培养所述产油微生物，其中所述ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率增 大，其中所述总脂肪酸含量没有变化。还公开了这样的方法，通过该方法可改良所述生物的脂肪酸分配比例以增大例如 epa浓度，该方法的实现是通过将直接作用于0nc-18的代谢途径的营养补充剂、化学刺激 物或抑制剂补充至发酵培养基或这种用于发酵并产生ω-3和ω-6脂肪酸的化学组合物 中。这些酶可具体被描述为具有延长酶、去饱和酶或脂肪酸合酶活性。据本发明人所知，以 下情况首次被发现，即明确鉴定——当其与发酵培养基结合时(在整个发酵过程中或在特 定的时间点)——可改变脂肪酸分配比例的化合物。这种化合物的实例包括存在于该具体 微生物的脂质生物合成途径中的脂肪酸中间体，例如油酸(见图14)，当将这种脂肪酸中间 体添加至发酵培养基中时会导致细胞中epa含量的提高。与metz等人(2001)的其中记录了油酸整合进入裂殖壶菌属种的实验数据相反， 没有发现发生该产物向多不饱和脂肪酸的转化。在该例中，通过使用13c标记的油酸，发现 了来源自所述富集油酸的13c存在于继后的多不饱和脂肪酸中并且构成了其余的epa浓度 升高。这证明了，将中间体脂肪酸整合至培养基中不仅可成功地整合进入细胞内，而且可成 功地整合进入活性去饱和酶、延长酶和脂肪酸合酶脂质合成系统。可采用多种方法来回收在多种培养基中发酵得到的细胞生物菌体，例如通过过滤 或离心。然后细胞经洗涤、冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥，并在无氧环境下储存以消除氧的存 在，然后将其掺入经加工的食品或饲料产品中。含有(n-3) dha, epa和(n_6) dpa等pufa的细胞脂质还可通过诸如超临界流体抽 提等方法，或通过采用溶剂例如氯仿、己烷、二氯甲烷或甲醇的抽提法从所述细胞生物菌体 中提取，并且将所得到的提取物在负压条件下蒸发，以产生经浓缩的脂质物质样品。所述 ω-3和ω-epufa可通过如下步骤进一步浓缩水解所述脂质，并通过采用常规方法例如尿 素包合法(urea adduction)或分馏、柱色谱法或通过超临界流体分级分离法浓缩高度不饱 和级分。还可破裂或裂解细胞并将脂质抽提至植物油或动物油(如鱼油)中。抽提得到的 油可通过通常用于提炼植物油的公知方法(例如通过化学提炼或物理提炼)来提炼。在抽 提得到的油作为食用油使用或出售前，这些提炼方法可将杂质从其中除去。提炼之后，该油 可直接用作饲料或食品添加剂以产生富含ω-3和/或ω-6的产品。或者，该油可按如下 所述进一步加工和纯化，然后用于以上应用，并且还可用于制药。在产生经富集的(浓缩的)ω-3或ω-6油的另一种方法中，所收集得到的细胞生 物菌体(新鲜的或经干燥的)可通过公知技术例如超声波处理、液体切力破裂方法、玻珠研 磨、高压挤压、冻融或细胞壁的酶消化来破裂或渗裂。破裂细胞中的脂质可使用某种溶剂 (例如己烷、氯仿、乙醚或甲醇)或溶剂的混合物来萃取。除去溶剂，并通过使用任何公知 的将甘油三酯转化为游离脂肪酸或脂肪酸的酯的方法(包括碱性水解、酸性水解或酶法水 解)来水解脂质。水解完成之后，将不能皂化的化合物萃取至溶剂例如乙醚、己烷或氯仿中 并除去。然后通过加入酸将剩下的溶液酸化，并将游离脂肪酸萃取至溶剂例如己烷、乙醚或 氯仿中。然后将含有该游离脂肪酸的溶剂溶液冷却至低到足以使非pufa化合物结晶的温度，随后所述非pufa化合物可通过过滤、离心或沉淀来除去。结果是剩下的pufa化合物得 到了浓缩并被用作人的营养补充剂、用作食品添加剂或用于药物应用。同时，公开了通过上文公开方法制备的脂质组合物。来自破囊壶菌科的微生物可为上文所公开的任何微生物。a)培养基异养培养基可包含(人工的或天然的)海盐、一种或多种碳源和一种或多种氮源。 该海盐存在的量可为约2. 0至约40. og l—1。标准培养条件(并非针对高浓度发酵，而是针 对低成本发酵)下所使用的碳源和氮源的浓度范围分别是5g l—1至60g l—1和4g l—1至iog l—1。对于高浓度发酵而言，标准培养条件下所使用的碳源和氮源的浓度范围分别是分别是 ioog l—1至160g l—1和40g l—1至60g l—1。油脂积累的趋势是产油微生物在(如上所述 的那些)培养基中生长，其中在约24至约48小时之后氮的供应受到了限制，而碳的供应依 然很富裕。该产油微生物继续吸收碳(单糖形式)，但是由于缺乏用于形成相关蛋白质和核 酸的氮而不再进行细胞分裂。结果是这些糖被转化成储备油脂，这与ratledge c. (lipid tech. 16 =34-39,2004)所描述的方式非常相似，图1给出这些生物体所特有的这一现象。氮源可为蛋白胨、酵母提取物、麦精和谷氨酸钠中的一种或多种。氮源还可为玉米 浆或棉籽提取物。氮源可含有酵母提取物和/或蛋白胨或谷氨酸单钠。例如，氮源可包括但 不限于 emd ye-msg.emd ye、emd peptone-msg,sigma ye-msg、sigma ye.fermtech ye-msg,fermtech ye或鱼粉(fish meal) (62%蛋白质)。酵母提取物所存在的量可为约 2g l—1。谷氨酸单钠存在的量可为约8g l—1。碳源可为如下物质中的一种或多种d_海藻糖、甘油、d-葡糖酸、l-乳酸、d，l-苹 果酸、d-核糖、吐温20、d-果糖、乙酸酯、乙酸、α -d-葡萄糖、麦芽糖、胸苷、l-天冬酰胺、 d-木糖、吐温40、α-酮基-戊二酸、蔗糖、l-谷氨酰胺、吐温80、β-甲基_d_葡糖苷、麦 芽三糖、腺苷、延胡索酸、溴代琥珀酸、l-丝氨酸、d-纤维二糖、l-丙氨酰基-甘氨酸、丙酮 酸甲酯、l-苹果酸、甘氨酰基-l-脯氨酸、d-palc0se、l-来苏糖、丙酮酸、α -d-乳糖、糊精、 d-阿拉伯糖、2-脱氧-d-核糖、明胶、右旋糖、淀粉、3-0-β-d-批喃半乳糖基-d-阿拉伯糖、 d-塔格糖、5-酮基-d-葡糖酸、草酰苹果酸(oxalomalic acid)、山梨酸、l-鸟氨酸和二羟基 乙酸酯。在一方面，碳源可为d，l-苹果酸、d-果糖、d-木糖、延胡索酸、d-纤维二糖、5-酮 基-d-葡糖酸、丙酮酸、α-d-乳糖、玉米糊精、明胶、玉米淀粉或小麦淀粉。碳源存在的量 可为约ig厂1至60g l-1并且上限至约200g l-1。在一个实例中，培养基含有约5g d-葡萄糖、约2g蛋白胨和约2g酵母提取物/升 盐水(天然的或人工的)。在另一实例中，所述培养基含有约60g d-葡萄糖、约iog酵母 提取物/升盐水(天然的或人工的)。在另一实例中，培养基可含有约8g酵母提取物、32g msg、24g海盐(天然的和人工的)和300g d-葡萄糖/升。所述培养基可进一步含有磷酸盐(如磷酸钾和磷酸钠)。所述培养基可进一步含 有无机盐(如硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸 锌、氯化钴、氯化铁、氯化镁)。所述培养基可进一步含有螯合化合物(如edta)。所述培养 基可进一步含有维生素(例如盐酸吡哆辛、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟 酸、生物素、叶酸和维生素b12)。培养基的ph为约4. 0至约6. 5。培养可进行约1至约9天(如约3天至约5天)。培养可在约18至约30°c (如约18-25°c )下进行。图8示出，当将0nc-t18按分批补料方案在发酵罐中于18和25°c下培 养88小时的时候，生物菌体生产、细胞的tfa和dha含量以及葡萄糖摄取速率的差异。在 该实例中，葡萄糖(或碳代谢)与tfa产生量的比例从8.1变化至3.0。这意味着，在18°c 下产生ig tfa需要8. ig葡萄糖，而在25°c下仅需要3. og葡萄糖。培养可进一步包括振荡 或通气。分离脂质的过程可包括将该微生物与萃取溶剂相接触。该溶剂可包括选自氯仿、 己烷、甲醇或乙醇或者超临界co2的一种或多种溶剂。该方法可产生本文所公开的任何组合物。在大于等于约20g γ1培养基中，该产油微生物可产生含n-3 dha的脂质组合物。 在大于等于40g l—1培养基中，该产油微生物可产生含n-3 dha的脂质组合物。在大于等于 80g l—1培养基中，该产油微生物可产生含n-3 dha的脂质组合物。2.筛选和鉴定方法本文所公开的产油微生物可产生含(n-3)系列二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸 以及(n-6)系列dpa的脂质。这些产油微生物可使用例如以下的筛选方法筛选。可(已经) 将营养体样品置于装有ioml无菌(0. 2 μ m过滤)天然海水(含有浓度分别为300和500mg l—1的青霉素和链霉素)的20ml小瓶中。然后用无菌花粉粒诱集小瓶，并在18至25°c下 培养48小时。然后将花粉粒转移至含抗生素(如上所述)的琼脂板上，并在相同条件下培 养。挑选由球形或蛞蝓形细胞构成的单个无规则透明集落和非典型的酵母或细菌集落，并 在与上文相同的培养基上和相同的条件下传代培养。然后使用营养液体培养基就生长情况 和脂肪酸产生情况对这些分离株进行筛选，所述营养液体培养基由含5g l—1葡萄糖、2g γ1 蛋白胨和2g l—1酵母提取物的经0. 2μπι过滤的天然海水制备，通过离心或沉淀收集液体培 养基中所得的细胞生物菌体。可使用常规方法直接对脂肪酸进行酯交换，并且可通过气相 色谱分析所述脂肪酸甲酯组合物，筛选产生恰当量n-3系列dha和n-6系列dpa的菌株用 于进一步研究中。公开了鉴定产油微生物的方法，所述方法包括用花粉粒诱集海水(天然海水或 人工海水)中的营养体样品并进行培养；将该花粉粒转移至异养培养基中并进行培养；并 鉴定产生脂肪酸的分离株。还公开了由上面鉴定得到的产油微生物所产生的脂质组合物。还公开了由使用所公开产油微生物的方法和本文公开的方法产生的脂质组合物。还公开了美国典型菌种保藏中心(american type culturecollection)编号为 pta-6245的产油微生物。还公开了属于破囊壶菌目的产油微生物(0nc-t18)，它们具有例如seq id no 1 所示的18s rrna，并被鉴定为破囊壶菌属种。还公开了属于破囊壶菌目的产油微生物(0nc-t18)，它们具有例如genbank编号 dq374149的18s rrna序列，并被鉴定为破囊壶菌属种。还公开了能产生浓度分别高于400mg l—1和ioomg l—1的dha和dpa的产油微生
物——破囊壶菌属种。还公开了能通过上述异养发酵产生范围在50至1250mg kg—1的类胡萝卜素以及能 产生范围分别在1至20mg kg—1的虾青素、0. 25至iomg kg—1的玉米黄素、1至20mg kg—1的角质素、1至20mg kg—1的海胆酮和1至200mg kg—1的β -胡萝卜素的产油微生物——破囊 壶菌属种。还公开了用于培养产油微生物的方法，该方法包括在某种条件下培养产油微生 物，其中所述条件包括含有如下组成的培养基人工海盐(营养性海水)形式、2. 0至15. og l—1的氯化钠；酵母提取物形式和谷氨酸单钠形式、浓度分别为2.0和8. og l—1的氮源；以及 葡萄糖形式、上限至130g l—1的碳。还公开了用于培养产油微生物的方法，该方法包括在 某种条件下培养产油微生物，其中所述条件包括含有如下组成的培养基人工海盐(营养 性海水)形式、2. 0至15. ogl-1的氯化钠；酵母提取物形式和谷氨酸单钠形式、浓度分别为 2. 0和8. og l—1的氮源；以及葡萄糖形式、上限至130g l—1的碳，还含有一种或多种脂肪酸 生产拮抗剂。所公开的方法可培养例如0nc-t18，使得总脂肪酸的至少24重量％为dha、至少6 重量％*dpa，并且至少1重量％*epa。所公开的培养方法还可培养例如0nc-t18，从而使得以重量计至少为类胡萝 卜素物质，其中以重量计1至2%并且至少1. 2%为虾青素，0. 25至并且至少0. 45%为
玉米黄素，5至16%并且至少9%为角质素，1至2%并且至少1.2%为海胆酮以及12至16% 并且至少为β-胡萝卜素。3.核酸存在多种基于核酸的本文公开的分子，包括例如编码例如rrna以及任何其他本 文公开的蛋白质的核酸，以及各种功能性核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物 或核苷酸替代物构成。这些和其他分子的非限制性实例在本文中有述。可以理解的是，例 如将载体在细胞中表达时，所表达的mrna通常由a、c、g和u/t构成。同样可以理解的是， 例如若将反义分子通过例如外源送递引入细胞或细胞环境内，则有利的是，所述反义分子 由可减少所述反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物构成。a)核苷酸和相关分子核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通过其磷酸部分 和糖部分形成核苷间键合而连接在一起。核苷酸的碱基部分可为腺嘌呤-9-基(a)、胞 嘧啶-1-基(c)、鸟嘌呤-9-基(g)、尿嘧啶-1-基(u)和胸腺嘧啶-1-基(t)。核苷酸 的糖部分为核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分为五价磷酸。核苷酸的非限制性实例为 3 ’ -amp (3 ’ -单磷酸腺苷)或5 ’ -gmp (5 ’ -单磷酸鸟苷)。核苷酸类似物为含有对碱基、糖或磷酸部分作出某些类修饰的核苷酸。对核苷酸 的修饰为本领域所熟知的，包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5_羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次 黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤，以及在糖或磷酸部分作出的修饰。核苷酸替代物为与核苷酸具有相似功能性但不含磷酸部分的分子，例如肽核酸 (pna)。核苷酸替代物为以watson-crick或hoogsteen方式识别核酸、但通过非磷酸部分 的部分连接在一起的分子。核苷酸替代物在与恰当的靶核酸相互作用时也能形成双螺旋型 结构。还能将其他形式的分子(缀合物)与核苷酸或核苷酸类似物连接起来以增强例如 细胞摄入。缀合物可通过化学方式连接核苷酸或核苷酸类似物。这类缀合物包括但不限于 脂质部分，例如胆固醇部分(letsinger et al. , proc. natl. acad. sci. usa, 86 -.6553-6556,1989)。watson-crick相互作用为与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的 watson-crick界面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的 watson-crick界面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的c2、m和c6位 以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的c2、n3和c4位。hoogsteen相互作用为发生在核苷酸或核苷酸类似物的hoogsteen界面的相互作 用，该界面暴露于双螺旋dna的大沟中。hoogsteen界面包括嘌呤核苷酸c6位的活性基团 (nh2或0)和n7位。b)序列有多个序列与例如seq id no=i以及本文公开的任何其他核酸和蛋白质(可能在 genbank公开)相关，并且这些序列和其他序列以及其中所含有的各个子序列通过援引全 部纳入本文。本文提供了多个序列，并且这些序列和其他序列可参见genbank(www. pubmed. gov)。本领域的技术人员明白如何分辨序列偏差和差异，并明白如何调整与某一具体序列 相关的组合物和方法，使其适应其他相关序列。根据本文所公开信息和本领域已知信息，可 设计任何序列的引物和/或探针。c)引物和探针公开了包括引物和探针在内的组合物，它们能与本文所公开的基因相互作用。在 某些实施方案中，引物用于支持dna扩增反应。引物通常能以序列特异方式被延长。序列特 异方式的引物延长包括任何方法，其中与引物杂交或以其他方式相关的核酸分子的序列和 /或组合物指导或影响通过引物延长所产生得到的产物的组合物或序列。因此，序列特异方 式的引物延长包括但不限于pcr、dna测序、dna延长、dna聚合、rna转录或反转录。优选以 序列特异方式扩增引物的技术和条件。在某些方面，引物可用作本文提及的破囊壶菌或杆 菌的种特异性或属特异性探针。在这种情况下，引物被可设计为特异性针对所述真核微生 物，并在随后进行pcr反应。然后可通过成功形成pcr产物来确定靶标种的存在。在某些 方面，所述引物还可用于dna扩增反应，例如pcr或直接测序。可以理解的是，在某些方面， 所述引物还可使用非酶促技术来延长，其中例如可修饰用于延长所述引物的核苷酸或寡核 苷酸，从而使得它们可以发生化学反应来以序列特异方式延长所述引物。通常，所公开的引 物可与核酸或核酸的某一区域杂交，或者它们可与所述核酸的互补序列或核酸某一区域的 互补序列杂交。d)核酸送递正如本领域普通技术人员所公知的那样，在包括将外源dna给予并被摄入受试者 的细胞内的上述方法(即基因转导或转染)中，所公开核酸可为裸露dna或rna形式，或者 所述核酸可存在于用于将所述核酸送递至所述细胞内的载体内，藉此编码抗体的dna片段 受到启动子的转录调节。载体可为商购制剂，例如腺病毒载体(quantumbiotechnologies， inc. (laval, quebec, canada) )0核酸或载体至细胞内的送递可通过多种机制。作 为一个实例，送递可通过脂质体进行，可使用商购脂质体制剂例如lip0fectin、 lipofectamine (gibc0-brl, inc.，gaithersburg, md)、superfect (qiagen，inc. hilden，德 国)和transfectam(promega biotec, inc.，madison, wi)，以及根据本领域的方法标准开
32发出来的其他脂质体。另外，所公开核酸或载体可通过电穿孔(由genetronics有限公司 (san diego,ca)提供的技术)以及通过s0n0p0rati0n机器(imarx pharmaceuticalcorp.， tucson, az)进行体内送递。作为一个实例，载体送递可通过病毒系统，例如可包装重组逆转录病毒基因组的 逆转录病毒载体系统进行(参见例如pastan et al.，proc. natl. acad. sci u. s. α. 85 4486,1988 ；miller et al.，mol. cell. biol. 6 :2895，1986)。该重组逆转录病毒随后可用 于感染细胞，并由此将编码主要中和抗体(或其活性片段)的核酸送递至该感染细胞中。 当然，将有所改变的核酸引入哺乳动物细胞的确切方法并不限于使用逆转录病毒。对于 该方法，还广泛存在其他技术，包括使用腺病毒载体(mitani et al. , hum. gene ther. 5 941-948，1994)、腺伴随病毒(aav)载体(goodman et al. ,blood 84 1492-1500，1994)、慢 病毒载体(naidini et al. ,science 272 :263_267，1996)和假型逆转录病毒载体(agrawal et al.，exper. hematol. 24 =738-747,1996)。还可使用物理转导技术，例如通过脂质体送 递和受体介导的送递以及其他胞吞机制进行(参见例如schwartzenberger et al. ,blood 87 =472-478,1996)。该公开的组合物和方法可与任何这些或其他通常使用的基因转移方法 一起使用。4.表达系统被送递至细胞的核酸通常含有表达调控系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中的 插入基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助调控所需基因产物的表达。启动子通常为 在距离转录起始位点相对固定的位置时起作用的一个或多个dna序列。启动子含有rna聚 合酶和转录因子之间发生基本相互作用所必需的核心元件，并且可含有上游元件和应答元 件。可以理解的是，除了下文讨论的通用系统之外，还有多种可用于本文所公开生物 体中的转录调控系统。可以理解的是，本文所公开生物体可用本文所阐述的多种基因例 (如标记基因)或者具有其他所需属性(例如增强或独特的生长特征)的基因进行转染和转化。a)病毒启动子和增强子哺乳动物宿主细胞中控制从载体转录的优选启动子可获自多种来源例如诸如以 下的病毒的基因组多瘤病毒、猿猴病毒40 (sv40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒，并且最 优选巨细胞病毒，或者获自异源哺乳动物启动子如β-肌动蛋白启动子。sv40病毒的早期 和晚期启动子通常以还含有sv40病毒复制起点的sv40限制性酶切片段的形式获得(fiers et al. ,nature，273 :113，1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子通常以hindiii e限制 性酶切片段的形式获得(greenway，pj. et al，gene 18:355-360,1982)。当然，来自宿主细 胞或相关种的启动子也可用于本申请。增强子通常指在距转录起始位点不固定距离起作用的dna序列，并且可在转录单 位的 5，端(laimins，l. et al.，proc. natl. acad. sci. 78 :993，1981)或 3，端(lusky，mx.， et al.，mol cell bio. 3 :1108，1983)。另外，增强子可位于内含子内(banerji，j. l. et al. , cell 33:729,1983)以及编码序列自身内(osborne, τ. f. , et al.，mol. cell bio. 4 1293,1984)。它们通常长10至300bp，并且它们以顺式方式起作用。增强子起提高从邻近 启动子开始的转录的作用。增强子通常还含有介导转录调节的应答元件。启动子还含有介导转录调节的应答元件。增强子通常对基因表达的调控起决定作用。尽管现在已知很多增 强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)，但是通常会使 用来自真核细胞病毒的增强子进行总体表达。优选的实例为复制起点后侧(100-270bp)的 sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤病毒增强子以及腺病毒 增强子。启动子和/或增强子可被激发其功能的光或特定化学事件特异性地激活。系统可 受诸如四环素和地塞米松的试剂调节。还存在通过暴露于辐照例如y辐照或烷化化疗药 剂来增强病毒载体基因表达的方法。在某些实施方案中，启动子和/或增强子区域可作为组成型启动子和/或增强子， 以最大限度表达待转录的转录单位区域。在某些构建体中，即便启动子和/或增强子区域 仅在特定时间在特定类型的细胞中表达，它在所有真核细胞类型中也均是具有活性的。这 种类型的优选启动子为cmv启动子(650bp)。其他优选的启动子为sv40启动子、巨细胞病 毒(全长启动子)和逆转录病毒载体lte。已表明，所有特定调节元件均可被克隆并用于构建在特定细胞类型如黑素瘤细胞 中选择性表达的表达载体。胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子已被用于在胶质来源 的细胞中选择性表达基因。在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载 体还可含有影响mrna表达的转录终止所必需的序列。这些区域被转录为编码组织因子蛋 白的mrna的非翻译部分中的多腺苷酸化区段。3’非翻译区域也可包括转录终止位点。优 选地，所述转录单位也含有多腺苷酸化区域。该区域的一个优点在于它增加了转录单位如 mrna被加工和运输的几率。表达构建体中多腺苷酸化信号的鉴定和使用已为本领域公知。 优选地，将同源多腺苷酸化信号用于转基因构建体中。在某些转录单位中，多腺苷酸化区域 来源于sv40早期多腺苷酸化信号，并由约400个碱基组成。还优选地，所述转录单位仅含 有其他标准序列或者同时含有上述序列，以提高所述构建体的表达或稳定性。b)标记物病毒载体可包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定该基因是否被送 递至细胞，并且一旦被送递则被表达。优选的标记基因为大肠杆菌lacz基因(编码β-半 乳糖苷酶)和绿色荧光蛋白。在某些实施方案中，标记可为选择性标记。合适的用于哺乳动物细胞的选择性标 记的实例为二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物g418、潮霉素和嘌呤 霉素。当这类选择性标记被成功转移至哺乳动物宿主细胞中时，若将经转化的哺乳动物细 胞置于选择压力下则它可存活。存在两类广泛使用的不同的选择方案。第一类以细胞代谢 和突变细胞系的使用为基础，所述突变细胞系缺乏不依赖补给性培养基而生长的能力。两 个实例为cho dhrf细胞和小鼠ltk细胞。这些细胞缺乏在不添加诸如胸苷或次黄嘌呤营 养物的情况下生长的能力。由于这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径所必需的某些基因， 因此若没有在补给性培养基中提供所缺少的核苷酸，则它们不能存活。补给培养基的另一 途径是将完整的dhfr或tk基因引入缺乏相应基因的细胞中，由此改变其生长需求。未能 由dhfr或tk基因转化的各个细胞将在非补给性培养基中不能存活。第二类为显性选择，所述显性选择指用于任一细胞类型中并且不需要使用突变细胞系的选择方案。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。具有新基因的这些细 胞会表达传送药物抗性的蛋白质，并且会在选择中存活。这种显性选择的实例使用药物新 霉素(southernp. and berg, p.，j molec. appl. genet. 1 :327，1982)、麦考酚酸(mulligan， r. c. and berg, p. science 209 -.1422,1980)或潮霉素(sugden, b. et al.，mol. cell. biol. 5 =410-413,1985)。这三个实例采用受真核生物基质控制的细菌基因，以分别赋予对 合适的药物g418或新霉素(遗传霉素)、xgpt (麦考酚酸)或潮霉素的抗性。其他实例包 括新霉素类似物g418和嘌呤霉素。5.月太类a)蛋白变体如本文所述，本文所公开生物体蛋白的多个变体都是已知的并在本文中被考虑。 另外，对于功能已知的破囊壶菌目的菌株而言，存在很多同样可用于所公开方法和组合物 的破囊壶菌目蛋白的衍生物。蛋白变体和衍生物为本领域的技术人员所熟知，并且可包括 氨基酸序列修饰物。例如，氨基酸序列修饰物通常包括以下三类中的一类或多类置换变 体、插入变体或缺失变体。插入包括氨基端和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸残基 的序列间插入。插入通常是比氨基端或羧基端融合的那些插入更小的插入，例如数量级为 一至四个残基的插入。免疫原性融合蛋白衍生物——例如那些在实施例中描述的免疫原性 融合蛋白衍生物——可通过如下方法制备得到通过体外交联或通过用编码融合物的dna 转化的的重组细胞培养物，将大到足以赋予免疫原性的多肽与靶序列融合在一起。缺失的 特征在于将一个或多个氨基酸残基从蛋白序列中除去。通常，蛋白分子内任一位置有不超 过约2至6个的残基缺失。这些变体通常可通过编码蛋白质的dna中核苷酸的位点特异性 诱变制备得到，由此产生编码所述变体的dna，并在随后于重组细胞培养物中表达dna。在 序列已知的dna中的预定位点进行置换突变的技术是公知的，例如m13引物诱变和pcr诱 变。氨基酸置换通常为一个残基，但是也可同时在多个不同位置处出现；插入的数量级通常 为约1至10个氨基酸残基；并且缺失的范围为约1至30个残基。缺失或插入优选在相邻 残基对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。置换、缺失、插入或它们的任一组合可联合 起来获得最终的构建体。突变不能将序列置于读码框之外，并优选不会形成可产生mrna 二 级结构的互补区域。置换变体为其中至少一个残基被除去并且一个不同残基被插入该位置 的那些变体。这类置换通常可依据下表1和2进行，并被认为是保守置换。功能或免疫性方面的显著改变可通过选择保守性不如表2的那些置换的置换来 实现，即选择在对保持下述结构或性质的影响方面的差异更显著的残基(a)置换区域中 多肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)靶位点的分子的电荷或疏水性或者(c)侧 链的大小。通常被预计会在蛋白性质方面产生的变化最大的置换为以下的这些置换(a) 亲水残基如丝氨酰基或苏氨酰基置换疏水残基如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨 酰基或丙氨酰基(或被它们置换)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换任何其他残基(或被它们置 换)；(c)带有正电侧链的残基如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基置换负电残基如谷氨酰基 或天冬氨酰基(或被它们置换)；或者(d)用具有大侧链的残基如苯丙氨酸置换不具有侧 链的残基如甘氨酸(或被它们置换)，在这种情况下，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位 点的数目。表1 氨基酸缩写
权利要求
一种制备脂质组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养培养基中培养产油微生物。
2.根据权利要求1的方法，还包括分离所述脂质组合物。
3.根据权利要求1的方法，其中ω-3和ω-6脂肪酸与ω-9脂肪酸的比率增大。
4.根据权利要求3的方法，其中总脂肪酸含量没有变化。
5.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为硅藻、微藻、真菌、细菌或原生生物。
6.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物具有18s序列，其中所述18s序列与 seq id no 1中列出的序列有至少94%的同一性。
7.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物具有18s序列，其中所述18s序列与 seq id no 1中列出的序列有至少80%的同一性。
8.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自网黏菌门 (phyiumlabyrinthulomycota)。
9.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自网黏菌纲 (ciasslabyrinthulomycetes)0
10.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌亚纲(subclass thraustochytridae)0
11.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌目(order thraustochytriales)0
12.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌科(family thraustochytriaceae)0
13.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌属(genus thraustochytrium)。
14.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为破囊壶菌属种。
15.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为金黄破囊壶菌(thraustochytrium aureum)。
16.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为粉红破囊壶菌(thraustochytrium roseum)0
17.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为纹状破囊壶菌(thraustochytrium striatum)。
18.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自裂殖壶菌属(genus schizochytrium)0
19.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为裂殖壶菌属种(schizochytrium sp. ) o
20.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物来自破囊壶菌科，并具有pta-6245、 20888、20889、20890、20891 或 20892 的 atcc 编号。
21.根据权利要求1的方法，其中所述产油微生物为0nc-18。
22.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸生产拮抗剂选自油酸、浅蓝菌素、甲基苯 甲酸、姜黄素、环丙烯、没食子酸烷基酯、没食子酸丙酯、芝麻油、花生油、菜籽油、哒嗪酮、氟 草敏、二苯胺、稀禾定和辣椒素。
23.一种包含权利要求1的脂质组合物的送递装置。
24.权利要求23的送递装置，其中所述送递装置可包括微囊、微球、纳米球或纳米颗 粒、脂质体、非离子表面活性剂囊泡(noisome)、纳米红质体、固体-液体纳米颗粒、亮丙瑞 林、凝胶、凝胶胶囊、片剂、洗剂、膏剂、喷雾剂、乳剂或粉剂。
25.一种包含基本微囊的聚集物和负载物质的微囊，各个基本微囊个体均具有主壳，其 中所述负载物质含有权利要求1的组合物，并被主壳包封，并且其中所述聚集物被外壳包 封。
26.权利要求25的微囊，其中所述主壳和/或外壳包含表面活性剂、明胶、聚磷酸酯、多 糖或它们的混合物。
27.权利要求25的微囊，其中所述负载物质包含来自破囊壶菌属、裂殖壶菌属或它们 的混合物的油。
28.权利要求25的微囊，其中所述外壳具有约1μ m至约2000 μ m的平均直径。
29.权利要求25的微囊，其中所述外壳具有约20μ m至约1000 μ m的平均直径。
30.权利要求25的微囊，其中所述外壳具有约30μ m至约80 μ m的平均直径。
31.权利要求25的微囊，其中所述主壳具有约40nm至约10μ m的平均直径。
32.权利要求25的微囊，其中所述主壳具有约0.1 μ m至约5 μ m的平均直径。
33.权利要求25的微囊，其中所述装载物质以重量计为微囊的约20%至约90%。
34.权利要求25的微囊，其中所述装载物质以重量计为微囊的约50%至约70%。
35.一种包含权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置或权利要求 25-34任一项的微囊的营养补充剂。
36.权利要求35的营养补充剂，其中所述补充剂为片剂、凝胶胶囊、胶囊、液体或糖浆 形式。
37.一种包含权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求 25-34任一项的微囊或权利要求35-36任一项的营养补充剂的食品。
38.权利要求37的食品，其中所述食品为烘焙食品、面食、肉制品、冷冻乳制品、乳制 品、奶酪制品、蛋制品、调味品、汤粉、点心、坚果制品、植物蛋白制品、硬糖、软糖、家禽制品、 经加工的果汁、砂糖、酱油、肉汁、糖浆、营养棒、饮料、饮料干粉、果酱或果冻、婴儿配方奶粉 或婴儿食品。
39.权利要求37的食品，其中所述食品为鱼肉制品、伴侣宠物食品、家畜饲料或水产养 殖饲料。
40.权利要求37的食品，其中所述食品为面包、玉米饼、谷物食品、香肠、鸡肉、冰淇淋、 酸奶、乳、沙拉调味料、米糠、果汁、饮料干粉、面包卷、饼干、薄脆饼干、水果馅饼或蛋糕。
41.一种送递组合物至受试者体内的方法，包括给予所述受试者权利要求23-24任一 项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利 要求37-40任一项的食品。
42.权利要求41的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
43.权利要求41的方法，其中所述受试者为人。
44.权利要求25-34任一项的微囊用于制备用于将负载物质送递给受试者的药物的用途。
45.一种降低受试者体内胆固醇水平、甘油三酯水平或它们的组合的方法，包括给予 所述受试者有效量的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求 25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品 的步骤。
46.一种补充受试者体内必需微量元素的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量 的权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微 囊、权利要求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤，其中所述 组合物、送递装置、微囊、添加剂和食品含有必需微量元素。
47.一种提高受试者体内胰岛素敏感度的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要 求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要 求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
48.一种减轻受试者体内高血糖症的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1 的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求 35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
49.一种减轻受试者体内高胆固醇血症的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要 求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要 求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
50.一种减少受试者体内体脂肪的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的 组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36 任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
51.一种促进受试者减肥的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要求1的组合物、 权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要求35-36任一项 的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
52.一种治疗或预防受试者体内糖尿病的方法，包括给予所述受试者有效量的权利要 求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递装置、权利要求25-34任一项的微囊、权利要 求35-36任一项的营养补充剂或权利要求37-40任一项的食品的步骤。
53.一种药物制剂，所述制剂包含权利要求1的组合物、权利要求23-24任一项的送递 装置或权利要求25-34任一项的微囊，以及药物载体。
54.一种包含权利要求1的组合物的药物制剂。
55.一种制备类胡萝卜素组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的 异养培养基中培养一种产油微生物。
56.权利要求55的方法，还包括分离所述类胡萝卜素组合物。
57.一种包含权利要求55的组合物的药物制剂。
58.一种制备抗氧剂组合物的方法，所述方法包括在含有脂肪酸生产拮抗剂的异养 培养基中培养一种产油微生物。
59.权利要求58的方法，还包括分离所述抗氧剂组合物。
60.一种包含权利要求58的组合物的药物制剂。
全文摘要
本发明公开了涉及可产生不饱和脂肪酸的产油微生物的组合物和方法，所述不饱和脂肪酸可被纯化及使用。本发明还公开了使用以下的脂肪酸生产拮抗剂来改良所述脂肪酸在总脂质组合物中浓度的方法，所述拮抗剂可抑制或刺激被认为存在于产油微生物中的经典脂肪酸生产途径的某些组件。
文档编号a61p39/06gk101981201sq200780036668
公开日2011年2月23日 申请日期2007年7月30日 优先权日2006年8月1日
发明者a·m·伯杰, c·j·巴罗, h·瑞迪亚宁塔斯 申请人:加拿大海洋营养食品有限公司