专利名称：一种利用片段化基因改组筛选性状优良菌株的方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌种改良领域，具体涉及一种利用片段化基因改组筛选性状优良菌株的方法。
背景技术：
酱油是东方调味品，以大豆、小麦为原料制造酱油是中国古代的发明。日本酱油的制作方法，是由中国传播过去的，但是酱油生产的机械化及纯菌种的应用首先是在日本实现的，新中国成立五十年来从作坊式生产不断进行工艺改造，逐步走向工业化生产，产品质量管理标准化，酱油生产以机械化取代手工操作，走上规模生产。酱油的主要质量指标为全氮和氨基酸态氮，生产酱油的主原料为含氮量较高的脱脂大豆。提高原料全氮利用率是生产考核的主要内容，目前国内一般在70％左右；中等水平为75％；先进水平为80％以上。提高原料的全氮利用率的方法除了改进生产工艺外，通过育种改良菌种特性也是常用的方法。酱油的酿造涉及到一个复合酶系，包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、肽酶和谷氨酰胺酶等，其中中性蛋白酶是主要的代表酶，因而菌种的中性蛋白酶的提高对酱油酿造是有益的。因此，能否获得中性蛋白酶提高的菌种显得非常重要。
工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具钉工业化价值及发酵过程成败与否的关键。经典育种方法是利用各种物理、化学因素进行随机突变，在工业微生物育种中作出过很大的贡献。但由于诱变效率低、耗时长、工作强度大，而且连续的诱变会造成诱变剂“疲劳效应”等等缺陷，要求一个新的育种方法的出现；我们目前对工业微生物的代谢途径、前体供应途径、中间产物、产物的运输等方面有限的知识也限制了利用代谢控制来进行菌种的选育；基因工程、代谢工程育种等是有前途的育种法，却由于缺乏相应的知识，工业菌种的遗传背景绝大多数不清楚，缺乏合适的遗传工具，使得随心所欲的进行基因重组改造细胞还为时过早，尚不能广泛应用于工业微生物育种。
利用各种物理、化学因素进行随机突变的经典育种方法尽管在工业微生物育种中作出过很大的贡献，但由于诱变效率低、耗时长、工作强度大，而且连续的诱变会造成诱变剂“疲劳效应”等等缺陷，要求一个新的育种方法的出现；由于我们目前对工业微生物的代谢途径、前体供应途径、中间产物、产物的运输等方面有限的知识也限制了利用代谢控制来进行菌种的选育；基因工程育种不可否认是一个有前途的育种法，却由于缺乏相应的知识，工业菌种的遗传背景绝大多数不清楚，缺乏合适的基因工具，使得随心所欲的进行基因重组改造细胞还为时过早，尚不能广泛应用于工业微生物育种。
近年来出现的一种新颖的育种方法解决了现代工业菌种选育中所面临的这些难题，具有很大的应用潜力，这就是基因组改组技术(gennome shuffling)，理论上能优化大多数工业产物的代谢途径和表型，操作直接，时间短，非常适合于工业应用。而且由于重组得到的菌株和基因修饰的有机体是不同的，可以直接用于食品工业。它不仅对工业，对医药应用来说也可以通过基因组随机重组提高表型，无疑是在细胞改进上的重要里程碑。
基因组改组技术是整个基因组的循环重组，可以同时在整个基因组的不同位点重组，将亲株的多个优良表型通过多轮的随机重组于同一株菌株，而不必要了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息，因此，工作的重点在于建立一个具有提高了表型的突变候选株的文库以供重组用和重组后的菌种的高通量筛选。
基因组改组技术灵感来自于自然界的生物进化过程，dna shuffling中dna片断重组时每代有多个亲本这一特点。基因组改组技术是由来源于一个原始亲株的多个具有提高表型的直接亲株，通过基因组的多轮连续随机重组技术，进行原生质体融合，得到的后代将汇集前代的优良表型。具体方法是首先选择一个原始亲株，通过经典育种法获得多个具有提高了表型的菌株构建为突变候选株文库，作为首轮多亲株融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，获得第一代融合株，再从中选择进一步获得表型提高的菌株作为第二轮融合的直接亲本，以此类推进行多轮的多亲株融合。此累积效应具有快速提高菌种的多个表型组合的效果，可以获得很多不同组合的多表型复合体，文库越大，原理上可获得的多表型组合就越多，但在一个复合体中含有的表型越多，融合中获得它的概率也就越小。例如s.coelicolor strains的四株原生质体单一的融合得到具有两个表型组合的后代的效率为10％，三个的为0.4％，四个的为0.00007％；然而多轮(四轮)的融合得到的具有两个表型组合的后代的效率为60％，三个的为17％，四个的为2.5％，提高了40～105倍。采用表型筛选法，优化范围从单个蛋白，整个代谢途径或前体供应途径，到整个基因组。基因组多轮随机重组技术具有如下优点将亲株的多个优良特性重组整合于同一株菌株，而不必要了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息，操作直接，时间短，能优化大多数工业产物的代谢途径和表型，非常适合于工业应用，而且由于重组得到的菌株和基因修饰的有机体是不同的，可以直接用于食品工业。但是基因组改组技术仍然存在如下不足重组效率不高，母本菌株的优良特性容易退化，产生的菌株种类比较单一等问题。
申请号200410023348.9，发明名称为《利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法》的中国专利公开了一种利用可转化大片段基因组文库发掘野生稻有利基因的方法。主要内容是供体野生稻可转化大片段基因组文库的构建是按琼脂包埋法制备megabase级的大片段水稻dna，再利用可转化人工染色体载体或者双元细菌人工染色体构建大片段基因组文库；转基因技术为农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、穗颈注射中的一种；供体植物为野生稻，受体植物为栽培稻。但是该方法存在如下缺点1.只能突变一个基因，但是表型的改变是由多个相关或连锁基因决定的，突变一个基因可能会造成表型的改变，但是可能改变很小。例如对高渗的耐受能力，一个基因是决定不了的。2.该方法先用ii型限制性内切酶消化，这一步只能获得某些特定的片断，因为ii型限制性内切酶的切割位点是特异的。该方法取200-600kb的大片段，接到人工染色体里面，还有抗性基因，这样的构建方法，即使得到突变子，再用到工业上，也是要经过很多步骤的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有基因组改组存在的问题，提供一种重组效率高，所得菌株多样性的利用片段化基因改组筛选性状优良菌株的方法。
本发明的片段化基因改组方法来自上述的基因组改组技术和自然界广泛存在的同源重组。重组和突变是物种变异的来源，重组可使有利和不利的基因分离，并作为一个单元在新的组合中被检验。它提供了一种方式是有利的等位基因得以保存，不利的基因被清除。通过重组获得基因的新的重组体允许该物种更快的适应环境并加速进化的进程，同时重组对dna损伤的修复也起重要作用。自然界的生物中普遍存在同源重组现象。同源重组是同源依赖性的，但不是序列依赖的，所以任何两个具有相关顺序的dna分子可以通过这个过程进行重组。同源重组有两个基本功能，遗传混合和dna修复。
为了实现上述目的，本发明采用片段化基因改组方法筛选性状优良菌株，具体为首先通过诱变育种获得目的性状提高的多株菌株，构成转化育种的候选亲株文库；在该文库中选出具有优良目的性状的菌株作为母本，也就是受体菌；再选出若干株优良性状的菌株作为多父本，即多供体菌；提取所选的多供体菌的总dna，用dnase i酶切，dnase i的浓度是0.002～0.004u，酶切时间20～30min；然后将混合dna片断转化受体菌，再生，筛选性状优良的再生菌株。
在上述方法中，还可以将所得优良性状有所提高的再生菌株作为新一轮转化的候选株文库，然后依照上述方法进行新一轮的改组筛选，以此类推进行多轮的转化循环，最后得到具有综合优良性状的突变株。
在上述方法中，可以将受体菌制备成原生质体，紫外灭活，再接受dna片断的转化；或是将受体菌制成感受态，再接受dna片断的转化。
上述转化方法的优选方法是电转化。
上述制备受体菌原生质体的方法是将受体菌在以下条件溶菌酶1％，蜗牛酶1％，纤维素酶1％，山梨醇渗透压稳定剂0.6m，ph7.0，温度33℃，酶解5h制得原生质体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)重组效率更高片段化的基因通过电转化更容易进入原生质体，而且断裂的单链或带缺口的双链片段复合同源重组的机制，重组更容易，因此重组效率更高。此外，转化前，供体菌原生质体要经过紫外灭活处理，可以诱导产生修复酶类，有利于诱导重组蛋白的产生，从而促进同源重组。(2)简化重组体筛选程序原生质体融合产物除中含有杂合二倍体、重组体外，还会产生异核体。需要经过几代的筛选分离纯化，才能获得稳定的重组体。片段化基因组改组可直接产生稳定的重组体。(3)产生的菌株具有更高的多样性本发明采用dnase i消化获得片段化基因组，避免了内切酶特异酶切位点的“限制”，可以获得随机性更大，更多可能实现同源重组的片断。(4)容易得到表型优良的菌种本发明是突变多个基因，由于表型的改变是由多个基因决定的，所以容易筛选到表型获得改良的菌种。
具体实施例方式
实施例11.材料受体菌从酱油曲精中分离出一株酱油曲霉，编号为bi。
供体菌从酱油曲霉bi的分生孢子原生质体经紫外诱变得到u系列中选出ui-2、uiii-21作为供体菌。
豆汁培养基kh2po4-1g，mgso4-0.5g，(nh4)2so4-0.5g，可溶性淀粉-20g，琼脂粉-20g，豆汁-1000ml；豆汁再生培养基kh2po4-1g，mgso4-0.5g，(nh4)2so4-0.5g，nacl-35.1g，可溶性淀粉-15g，琼脂粉-20g，豆汁1000ml。
酪蛋白水解培养基na2hpo4·7h2o-1.07g，kh2po4-0.36g，酪蛋白-8g，琼脂粉-20g，h2o-1000ml。ph6.5～7.0；三角瓶种曲培养基麸皮-85g、豆粕粉-15g、水-95ml。
2.实验方法2.1原生质体制备孢子悬浮液制备无菌水洗脱新鲜斜面的孢子至装有玻璃珠的试管，振荡使孢子分散，过滤除去菌丝和成团的孢子。
b-巯基乙醇预处理离心收集孢子悬浮液(8000rpm，5min，4℃)，用10ml的无菌水悬浮，加0.1ml edta，17.34μlβ-巯基乙醇，室温下轻柔振荡处理20min。酶解离心收集菌体，无菌水洗涤1次，渗透压稳定剂悬浮，加入酶液，33℃水浴酶解。
取样取样离心去除反应液，沉积的孢子用渗透压稳定剂洗涤一次，离心收集，渗透压稳定剂重悬，置冰中备用。
2.2诱变菌株孢子原生质体的片段化基因组改组(1)供体菌株总dna的提取供体菌株ui-2和uiii-21摇瓶培养48h得到幼龄菌丝体，将湿菌丝球于-80℃中冰冻过夜，然后冻干24h；研磨至粉末状，加20mg-60mg于1.5ml离心管中；加入400μl溶菌缓冲液，混匀直至出现匀浆；65℃温育1h；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀；12000rpm离心15min，吸取上清液；加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，12000rpm离心15min，吸取上清夜；加入10μl 3mol/l naac、0.54倍体积的异丙醇，轻轻倒转混匀；12000rpm离心15min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次；用50μl无菌水溶解沉淀。
(2)酶切表1dna酶切体系
酶切20min，琼脂糖凝胶电泳，并回收300-500bp左右的片断。
(3)原生质体制备将紫外诱变所得的酶活已经有所提高的菌株u系列作为多亲株电融合的受体菌株，在以下条件，溶菌酶1％ 蜗牛酶1％ 纤维素酶1％，山梨醇渗透压稳定剂(0.6m，ph7.0)，酶解温度33℃，酶解5h，制得其分生孢子的原生质体备用。
原生质体灭活处理将所制备的原生质体用紫外灭活(15w，照射距离10cm，时间15min，原生质体浓度108个/ml)。
(4)电转化指数衰减波(电压，电容，电阻、脉冲个数)2500v、25uf、200ohm、3。
(5)初筛将再生菌株分别穿刺接种于酪蛋白水解平板上，同时接一株出发株bi作为对照，30℃恒温培养后测量其hc值(hc＝水解圈直径/菌落直径)。挑选hc值明显大于bi的再生菌株进行复筛。
(6)复筛将待测菌株制成孢子悬浮液，接种于三角瓶种曲培养基中，30℃培养50h左右，待嫩黄色的孢子长满时，分别取样1g，105℃烘干，计算湿重干重比，再各取样1g，用于粗酶液的浸提。
粗酶液的浸提与福林酚法测定中性蛋白酶活粗酶液的浸提取种曲样品1g，加入0.14m nacl 30ml，37℃浸提3小时，离心提取酶液。采用福林酚法测定中性蛋白酶活，筛选中性蛋白酶活高的目的菌种，结果见表2。
3结果3.1中性蛋白酶活筛选结果在经过一轮的片段化基因组改组电转化后，得到再生的单菌落56株，编号为t系列。通过初筛和复筛，获得5株中性蛋白酶活得到提高的目的菌种，其中菌株t-3、t-32、t-52的形态类似供体菌，而菌株t-15、t-51颜色为白色、绿色相杂。可见，经过一轮的片段化基因组改组电转化后，中性蛋白酶获得提高的菌株的转化率为8.9％。可以将所得中性蛋白酶获得提高的菌种进行下一轮改组筛选，提高转化率，筛选形状优良的菌株。
表2转化复筛结果(中性ph7.2酶活/g干基)bi3191.0u
权利要求
1.一种利用片段化基因改组筛选性状优良菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)通过诱变育种获得目的性状提高的多株菌株，构成转化育种的候选亲株文库；(2)在该候选亲株文库中选出多株具有优良目的性状的菌株分别作为受体菌和供体菌；(3)提取多株供体菌的总dna，dnase i酶切，混合；(4)将酶切后的dna片断混合物转化经紫外灭活的受体菌，所得再生菌即为目标转化菌株，以表型为筛选标记，筛选性状优良的再生菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还可以将步骤(4)筛选所得优良性状的再生菌株作为新一轮转化育种的候选亲株文库，依照权利要求1所述方法进行新一轮的片段化基因改组筛选，多轮积累，得到优良性状的再生菌株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，先将步骤(4)所述的受体菌制备成原生质体，再接受dna片断混合物的转化。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，先将步骤(4)所述的受体菌制备成感受态的受体菌，再接受dna片断混合物的转化。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化为电转化。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dnase i酶的浓度是0.002～0.004u，酶切时间20～30min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述原生质体的制备方法是将受体菌在以下条件溶菌酶1％，蜗牛酶1％，纤维素酶1％，山梨醇渗透压稳定剂0.6m，ph7.0，温度33℃，酶解5h制得原生质体。
全文摘要
本发明涉及微生物菌种改良领域，具体涉及一种利用片段化基因改组筛选性状优良菌株的方法。本发明通过诱变育种获得目的性状提高的多株菌株，构成转化育种的候选亲株文库；在该文库中选出具有优良目的性状的菌株作为母本，也就是受体菌；再选出若干株优良性状的菌株作为多父本，即多供体菌；提取所选的多供体菌的总dna，用dnase i酶切；然后将混合dna片断转化受体菌，再生，筛选性状优良的再生菌株。利用本发明筛选方法所得的菌株的重组效率高，重组体筛选程序简单，所得菌株多样性高。
文档编号c12n15/01gk1844384sq200610035370
公开日2006年10月11日 申请日期2006年5月8日 优先权日2006年5月8日
发明者潘力, 李立岚, 叶燕锐 申请人:华南理工大学