1.本发明涉及灰霉病防治技术领域，具体涉及一种微生物固体熏蒸制剂的制备方法及其在灰霉病防治中的应用。
背景技术：
2.灰葡萄孢（botrytis cinerea）隶属于核盘菌科、孢盘菌属，是一种典型的坏死营养型病原菌，寄主广泛，能够引起番茄、草莓、葡萄、樱桃等1400种植物表面腐烂并形成灰色霉层。不仅如此，灰葡萄孢还可以侵染植物的多个部位，如果实、花、叶、茎等其他植物器官，在采前和采后都会引起严重的病害。灰葡萄孢的寄主非特异性和感染器官类型多样，导致其造成巨大的农业种植和采后损失（jiao et al., organic acid, a virulence factor for pathogenic fungi, causing postharvest decay in fruits. mol plant pathol. 2022）。据统计，全球每年因各种作物灰霉病的发生而导致的经济损失高达1000亿美元，对全球农业发展具有重大危害。
3.多年来，应用化学气体和化学杀菌剂是防治灰霉病的有效途径。然而，化学农药的长期使用导致了环境污染、食品安全问题以及对人体健康的不良影响。此外，由于灰葡萄孢传播速度快，寄主范围广，遗传变异量大，在过去的几十年中由于大量施用化学药剂而产生严重的抗药性。目前已经出现了对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和n-苯基氨基甲酸酯类等多种杀菌剂的抗性菌株（韩之琪等，灰葡萄孢对杀菌剂抗性研究进展，中国蔬菜，2014）。
4.微生物挥发性有机物（microbial volatile organic compounds，mvocs）是低沸点、低分子质量(《300 da)和高蒸汽压的亲脂性化合物。部分微生物产生的vocs 具有抑制病原菌的作用，能有效防控多种植物和农作物的病害。与传统液态药剂相比，mvocs具有低浓度被感知的优势，易于在土壤、空气等环境中远距离扩散，微生物可以在不直接接触病原菌和植物的情况下，通过其产生的抗菌vocs抑制病原菌生长，在植物病害防治中展现出巨大的应用潜力（sharifi et al., belowground plant-microbe communications via volatile compounds. j exp bot. 2022）。目前，有关mvocs应用于灰霉病防治的报道较为少见。
技术实现要素：
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种微生物固体熏蒸制剂的制备方法及其在灰霉病防治中的应用，该微生物固体熏蒸制剂不在被处理农产品上引入活菌，是一种安全高效的生防菌剂。
6.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种微生物固体熏蒸制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1，取新鲜的麦粒冲洗干净，并加水煮至麦粒开口，过滤后风干，称取风干后的麦粒至锥形瓶，摇匀铺平瓶底，高温灭菌处理2次，得麦粒培养基；121℃灭菌15 min，重复灭
菌2次，得到；步骤2，取西塘链霉菌wy228，接种于isp-2培养基中，28℃下180rpm培养2 d，得到西塘链霉菌wy228发酵液；步骤3，将西塘链霉菌wy228发酵液接入麦粒培养基中，充分混匀后，静置培养，培养期间每天摇瓶2次，培养结束后，烘干后保存，即得微生物固体熏蒸制剂。
7.作为改进的是，步骤1中称取风干后的麦粒接入锥形瓶中的量为10-40g/50g，风干后麦粒的含水率为33%-50%，高温灭菌的条件为121℃灭菌15 min。
8.作为改进的是，步骤3中西塘链霉菌wy228发酵液的接入量为5-10%，静置培养的温度为20-28℃，培养天数2天。
9.作为改进的是，步骤3中烘干采用35℃下烘箱干燥24h，保存采用的4℃低温真空保存。
10.上述制备方法得到的微生物固体熏蒸制剂。
11.上述制备方法制备得到的微生物固体熏蒸制剂在抑制灰葡萄孢上的应用。
12.作为改进的是，取微生物固体熏蒸制剂复水处理后，与待处理农产品共同放置于密闭容器内，所用微生物固体熏蒸制剂的浓度26.67 g/l，通过产生的vocs对灰葡萄孢的抑制效果，实现灰霉病的预防或治疗。
13.进一步改进的是，所述复水处理采用的是无菌水或营养液。
14.进一步改进的是，所述营养液的组分为胰蛋白胨6 g/l、葡萄糖4 g/l，添加1% cacl2。
15.一种防治草莓灰霉病的生物制剂，所述生物制剂含有上述制备方法制备得到的微生物固体熏蒸制剂。
有益效果
16.与现有技术相比，本发明一种微生物固体熏蒸制剂的制备方法及其在灰霉病防治中的应用，具体优势如下：1、本发明提供的微生物固体熏蒸制剂可产生抑菌性气体，易于在土壤、空气等环境中远距离扩散，制剂不与被处理农产品直接接触，不在其表面引入活菌；2、本发明提供的微生物固体熏蒸制剂不在被处理农产品表面喷洒水性溶剂，尤其适用于表面容易损坏或腐烂、不宜用液态药剂处理的农作物，如草莓、蓝莓、生菜等；3、本发明提供的微生物固体熏蒸制剂安全高效，成本低廉，使用简便，在灰霉病的防治中具有较好的市场应用前景。
附图说明
17.图1为西塘链霉菌wy228熏蒸制剂优化的发酵工艺，其中，a为不同接种量，b为装瓶量，c为料水比，d为培养温度，e为不同剂量，f为不同培养时间；图2为西塘链霉菌wy228熏蒸制剂优化的制备工艺流程图；图3为西塘链霉菌wy228熏蒸制剂中优势化合物的体外抑菌活性检测；图4为西塘链霉菌wy228熏蒸制剂对草莓灰霉病的防控作用实施例照片；图5为西塘链霉菌wy228熏蒸制剂对草莓灰霉病的防控作用实施后，草莓理化指标
测定，其中，（a）为疾病指数，（b）为失重率，（c）为抗坏血酸，（d）为可滴定酸，（e）为硬度，（f）为可溶性固形物，（g）为总酚，（h）为黄酮，（i）为丙二醛，（j）为超氧化物歧化酶sod酶活。
具体实施方式
18.马铃薯葡萄糖琼脂培养基：200 g土豆，20 g葡萄糖，15 g琼脂，1000 ml蒸馏水，ph自然，115℃灭菌30 min。
19.isp-2：4 g酵母粉，4 g葡萄糖，10 g麦芽浸粉，15 g琼脂，1000 ml蒸馏水，ph 7.2，115℃灭菌30 min。
20.isp-3：20 g燕麦片加入1000 ml蒸馏水，制成匀浆，四层纱布过滤，补足蒸馏水到1000 ml，加入15 g琼脂，ph 6.0，121℃灭菌20 min。
21.isp-5：1.0 g l-天门冬酰胺，10 g甘油，1.0 g磷酸氢二钾，15 g琼脂，1000 ml蒸馏水，ph 7.2，121℃灭菌20 min。
22.胰蛋白胨大豆琼脂培养基（tsa培养基）： 15 g胰蛋白胨，5 g大豆蛋白胨， 5 g nacl，1000 ml蒸馏水，15 g琼脂，ph 7.2，121℃灭菌20 min。
23.麦粒培养基：将小麦粒洗净后煮至开口，底层纱布过滤，晾干后，称取适量小麦粒放入锥形瓶中，121℃灭菌30 min。
24.西塘链霉菌wy228为牛蒡内生菌，由本实验室分离自江苏省徐州市沛县河口镇地区田间健康牛蒡植株，于2017年11月8日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号gdmcc no：60274，分类学名称：streptomyces sp.。
25.西塘链霉菌wy228发酵液：将活化的西塘链霉菌wy228接种于isp-2培养基中，28℃下180rpm培养2 d。
26.灰葡萄孢购于广东省微生物菌株保藏中心，菌种保藏编号为gdmcc 3.47。
27.麦粒制剂复水方式：分别添加无菌水或营养液，使麦粒制剂的最终含水量为33%-50%，于28℃培养箱内静置培养过夜。
28.活菌数量的测试方式：取一定量复水后的麦粒制剂置于无菌离心管中，加入适量无菌水，放置于涡旋震荡仪上进行震荡，吸取1 ml涡旋震荡的菌液在isp-2培养基上进行稀释涂布，放置于28℃培养箱内进行静置培养2 d，进行活菌计数。
29.抑菌活性的检测方式：取一定量复水后的麦粒制剂放置于分隔平皿的一侧，同时接种灰葡萄孢菌饼（5 mm）于另一侧的pda培养基上，封口后再置于28℃培养3 d。量取菌落直径，计算抑菌率。
30.实施例1 西塘链霉菌wy228在不同培养基上对灰葡萄孢的抑制作用检测在分隔平板的左侧隔室内加入适量的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，接种直径5 mm的灰葡萄孢菌饼。在分隔平板的右侧隔室内分别加入适量的isp-2、isp-3、isp-5、胰蛋白胨大豆琼脂培养基或麦粒培养基，均匀接种500μl的西塘链霉菌（streptomyces setonii）wy228发酵液菌液。封口膜密封后，将平板置于28℃的培养箱中培养3 d，测量菌落直径计算抑制率。
31.结果表明，西塘链霉菌wy228在isp-2、isp-3、isp-5培养基上产生的vocs对灰葡萄孢几乎无抑制作用，在tsa培养基以及麦粒培养基上产生的vocs对灰葡萄孢呈现出极强的
抑菌效果。麦粒是营养丰富的天然介质，含有丰富的淀粉和小分子蛋白质，其疏松的结构便于良好的通风。因此，选择麦粒进行灰霉病专用微生物菌剂的制备。
32.实施例2 西塘链霉菌wy228的灰霉病专用微生物熏蒸制剂的制备方法将新鲜麦粒冲洗三遍，加水煮至麦粒全部开口，过滤沥干水分后室温风干。称10 g麦粒分装至50 ml锥形瓶，摇匀铺平瓶底，121℃灭菌30 min，得到麦粒培养基。
33.2.1 wy228麦粒制剂发酵工艺的优化（1）不同接种量对wy228麦粒制剂抑制灰葡萄孢的影响：在50 ml锥形瓶内装入10 g麦粒培养基，分别以1%（100μl)、3%（300μl）、5%（500μl）、10%（1000μl）的接种量加入西塘链霉菌wy228发酵液，与麦粒充分混匀后置于28℃静置培养2 d，培养期间每天摇瓶两次，然后转移至分隔平板一侧，同时接种灰葡萄孢菌饼（5 mm）于分隔平板另一侧的pda上，封口，28℃培养3 d。测量菌落直径计算抑制率。
34.（2）不同培养温度对wy228麦粒制剂抑制灰葡萄孢的影响：在50 ml锥形瓶内装入10 g麦粒培养基，以 5%接种量加入菌株wy228发酵液，与麦粒充分混匀后分别置于20、25、28℃培养2 d，期间每天摇瓶两次，培养结束后转移麦粒于分隔平板一侧，同时接种灰葡萄孢菌饼（5 mm）于另一侧的pda上，封口后再分别置于20、25、28℃培养3 d。测量菌落直径计算抑制率。
35.（3）不同装瓶量对wy228麦粒制剂抑制灰葡萄孢的影响：在50 ml锥形瓶内分别装入10、20、30、40 g麦粒培养基，以 5%接种量加入菌株wy228发酵液，与麦粒充分混匀后置于28℃培养2 d，每天摇瓶两次。每种装瓶量分别称取10 g麦粒制剂置于分隔平板一侧，同时接种灰葡萄孢菌饼（5 mm）于另一侧的pda上，封口后再置于28℃培养3 d。测量菌落直径计算抑制率。
36.（4）不同含水量对wy228麦粒制剂抑制灰葡萄孢的影响：称取麦粒不煮直接装瓶灭菌，其料水比1：0（含水量0%）；称取一定量的麦粒，煮至炸裂后晾干至其原来重量的1.5倍，其料水比2：1（含水量33%）；称取一定量的麦粒，煮至炸裂后晾干至原来重量的2倍，其料水比1：1（含水量50%）；称取一定量的麦粒，煮至炸裂后晾干至原来重量的3倍，料水比1：2（含水量67%）。西塘链霉菌wy228发酵液以 5%接种量接种，将菌体与麦粒培养基充分混匀后28℃培养2 d，每天摇瓶2次，分别称取不同含水量的麦粒制剂10 g置于分隔平板一侧，同时接灰葡萄孢菌饼（5 mm）于另一侧的pda培养基上，封口后再置于28℃培养3 d。测量菌落直径计算抑制率。
37.（5）不同剂量对wy228麦粒制剂抑制灰葡萄孢的影响：将西塘链霉菌wy228发酵液以 5%接种量接种于装有10 g麦粒培养基的50 ml锥形瓶内，充分混匀后置于28℃培养2 d，期间每天摇瓶两次，培养结束后分别称取2、4、8 g麦粒制剂于分隔平皿一侧，同时接种灰葡萄孢菌饼（5 mm）于另一侧的pda上，封口后再置于28℃培养3 d。测量菌落直径计算抑制率。
38.（6）不同培养天数对wy228麦粒制剂抑制灰葡萄孢的影响：将西塘链霉菌wy228的发酵液以 5%接种量接种于装有10 g麦粒培养基的50 ml锥形瓶内，充分混匀后置于28℃分别培养2、3、4 d，期间每天摇瓶两次，称取不同培养天数的4 g麦粒制剂于分隔平皿一侧，同时接种灰葡萄孢菌饼（5 mm）于另一侧的pda上，封口后再置于28℃培养3 d。测量菌落直径计算抑制率。
39.通过对一系列发酵工艺进行优化，wy228麦粒制剂的抑菌活力逐步提高。如图1所示，在20-28℃范围内，西塘链霉菌wy228接种量为5-10%，装瓶量在10-40 g范围内，料水比为2:1（含水量33%）至1:1（含水量50%）之间，麦粒培养基剂量为4-8 g时，培养天数为2 d时，wy228麦粒制剂对灰葡萄孢的抑菌率达到100%，为最佳的发酵工艺。
40.2.2 wy228麦粒制剂制备工艺的优化（1）最佳干燥方式的优化设计两种方案:方案一为保证不同干燥处理后最终的含水量均为15%，操作方式如下：自然干燥：将wy228麦粒制剂分装于一次性无菌平皿中，置于超净台内敞口静置室温风干；烘箱干燥：将烘箱温度调节至35℃，将wy228麦粒制剂分装于一次性无菌平皿中，置于紫外杀菌过的烘箱内，敞口烘干；真空冷冻干燥：将wy228麦粒制剂分装于50 ml无菌离心管中，置于超低温冰箱中冷冻过夜后真空冷冻干燥。
41.方案二为保证不同干燥处理的烘干时间一致。将wy228麦粒制剂分别采用上述自然干燥、烘箱干燥、真空冷冻干燥三种干燥方式，烘干时间为24 h。
42.干燥方案一中的三种干燥方式均未完全烘干水分，导致麦粒制剂在保存期间可能会发生霉变。
43.方案二中的烘箱干燥可将水分完全蒸发，保证麦粒的干燥程度，不易霉变，较低的水分含量使菌体处于休眠状态，有利于保证菌体的抑菌活性。
44.因此，35℃烘箱干燥24 h是最佳的干燥方式。
45.（2）对最佳储存方式的优化，将35℃烘箱干燥24 h后的wy228麦粒制剂分别在室温真空保存、4℃保存和4℃真空保存。对麦粒制剂的抑菌活性和活菌数量进行检测发现，4℃真空保存是最佳的储存方式。在该储存条件下，货架期90 d后，麦粒制剂的抑菌活性仍在70%以上，活菌数量也未发生明显的下降，优于4℃保存和室温真空保存。
46.（3）对最佳复水条件的优化，复水液分别采用无菌水、自制营养液和tsa营养液。自制营养液（g/l）为胰蛋白胨6 g（氮源）、葡萄糖4 g（碳源），添加1% cacl2。tsa营养液为tsa培养基稀释5倍使用，添加1% cacl2。分别添加不同复水液使麦粒制剂的最终含水量为33%和50%，置于28℃培养箱内静置培养过夜，次日分别通过抑菌活性、活菌数量两个指标来检测麦粒制剂的活性。
47.麦粒制剂的货架期评价：采用前期得到的最佳发酵工艺、干燥方式和储存方式，分别于15 d，30 d，90 d取样以不同的复水条件进行复水，对麦粒制剂的抑菌活性和活菌数量进行评价。
48.在复水液的选择上，无菌水和自制营养液的表现效果俱佳，但从经济角度考虑，可选择无菌水作为复水液，复水后33%和50%含水量对麦粒制剂的抑菌效果无显著差异。如图2所示，wy228麦粒制剂的最佳制备工艺为，35℃烘箱干燥24 h，4℃真空条件下可保存90 d左右，自制营养液或无菌水为最佳复水液。
49.实施例3 西塘链霉菌wy228菌剂的应用试验3.1 wy228麦粒制剂vocs成分鉴定经顶空固相微萃取-气质联用分析，发现wy228麦粒制剂共产生128种vocs。其中，含量超过1%的化合物分别是土味素（36.12%），2,4-呋喃二羧酸二甲酯（11.80%），2-甲基丁酸（9.32%），4-甲基己酸（3.57%），2-甲基丙酸（1.59%），1,4-二甲基金刚烷（1.38%），4-甲基
丙酸（1.21%）, 2-糠酸甲酯（1.13%），环戊酮（1.12%）。
50.其中，可以购买到的四种单体化合物在28℃和22℃时对灰葡萄孢具有较强的抑制作用。由图3可以看出，在28℃时，这四种化合物对于灰葡萄孢都有抑制作用。4-甲基戊酸的浓度达到50 μl/皿时，其抑菌率可达到80%左右；2-糠酸甲酯和2-甲基丁酸在浓度为30 μl/皿时，其抑菌率已接近100%；环戊酮在浓度达到50 μl/皿时，可完全抑制灰葡萄孢的生长。在22℃时，2-糠酸甲酯的浓度为50 μl/皿时，可完全抑制灰葡萄孢的菌丝生长。2-甲基丁酸浓度达到50 μl/皿时，其抑菌率接近90%。4-甲基戊酸浓度达到50 μl/皿时，其抑菌率为70%左右。环戊酮浓度为50 μl/皿时，其抑菌率为80%。
51.3.2 wy228麦粒制剂对草莓灰霉病的防控作用挑选表面无损伤、成熟度一致和大小相近的草莓，清水洗净后用体积分数为75%乙醇的浸泡30 s，无菌水冲洗2次后，置于超净台内吹干。用无菌竹签在草莓腰部制造伤口，接种10μl灰葡萄孢孢子悬液（1
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106个孢子/ml），放入无菌餐盒中（体积为0.75 l）。在餐盒中远离草莓处放置平皿，分别加入20 g或40 g wy228麦粒制剂，检测该熏蒸制剂对草莓灰霉病的防控作用，以直接喷洒多菌灵（1:1000倍稀释）作为阳性对照。
52.wy228麦粒制剂熏蒸处理后，接种灰葡萄孢的草莓未发生灰霉病，未接种灰葡萄孢的草莓未出现果实质感和颜色的变化。如图4所示，图中control为空白对照组，bc为接种灰葡萄孢组，carbendazim为多菌灵组，20 g wheat seeds 为20 g麦粒制剂熏蒸组，20 g wheat seeds bc 为接种灰葡萄孢并用20g麦粒制剂熏蒸组，40 g wheat seeds 为40 g麦粒制剂熏蒸组，40 g wheat seeds bc为接种灰葡萄孢并用40g麦粒制剂熏蒸组。从图中可以看出，仅接种灰葡萄孢的bc组中草莓的灰霉病病斑明显，wy228麦粒制剂熏蒸后，20 g wheat seeds bc 和40 g wheat seeds bc 中的20 g和40 g wy228麦粒制剂均完全抑制了灰葡萄孢的侵染，草莓未发生灰霉病病症，达到了与carbendazim组中直接喷洒多菌灵同等的防控效果。未接种灰葡萄孢的20g wheat seeds 和40g wheat seeds组中，20g wy228麦粒制剂和40g wy228麦粒制剂未改变草莓的颜色和质地，与control对照组中的草莓无异。
53.如图5所示，26.67 g/l 的wy228麦粒制剂熏蒸处理后，不仅完全抑制了草莓灰霉病的发生（图5（a）），还控制了果实的失重率降低（图5（b）），较好保持了果实维生素c（图5（c））和可滴定酸（图5（d））的含量，果实硬度未下降（图5（e）），延缓果实中可溶性固形物的增加，控制果实的快速成熟与老化（图5（f）），与抗逆相关的总酚（图5（g））和类黄酮（图5（h））升高，膜脂过氧化标志物丙二醛含量降低（图5（i）），超氧化物歧化酶活力升高（图5（j）），显著提高了草莓果实的抗性,有助于改善草莓采后贮藏期间的品质。综上所述，本发明微生物固体熏蒸制剂通过产生抑菌性气体显著抑制灰葡萄孢生长，且不在被处理农产品表面引入活菌和多余水分，对灰霉病具有安全且高效的防治能力，具有较好的市场应用前景。