工作电极生物反应物及电极式测试条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及电化学检测技术领域，特别涉及工作电极生物反应物及电极式测试 条。
【背景技术】
[0002] ?00'，即时检验(口〇;[111：-0;1^-03代七6 81:;[1^)，指在病人旁边进行的临床检测，通常 不一定是临床检验师来进行。多数情况下p0ct是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实 验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。现在p0ct已成为检验医学 的重要组成部分，因其实验仪器小型化、操作简单化、报告结果即时化受到人们的青睐。
[0003] 基于酶安培生物传感器原理的电化学测试条广泛应于各种即时检测(p0ct)产品， 如已商品化的血糖、血酮、血脂和血肌酐电化学测试条。一般，电化学测试条表面含有识别 目标分析物的特异性酶分子以及辅酶或电子介体，目标分析物在电化学测试条表面发生酶 促氧化还原反应，转换为可收集和测量的电信号(氧化或还原电流），通过酶生物化学反应 (信号转换)和电化学反应(信号收集与测量)两步可实现对目标分析物的定量检测。
[0004] 通常，目标分析物在工作电极表面产生酶促反应电流信号的过程中，血液中存在 的多种内源或外源的还原性干扰物亦会参与电流信号的发生过程，对测量结果造成正或负 的干扰，其中以抗坏血酸的干扰最为常见。对于以氧化电流为检测信号的电化学测试条(如 血糖或血酮电化学测试条），抗坏血酸可在电极表面被直接电氧化或被氧化型电子介体氧 化，故所测氧化电流为目标分子产生的真实电流和抗坏血酸产生的干扰电流的累加，导致 测量结果为正偏差。对于以还原电流为检测信号的电化学测试条(如血脂或血肌酐电化学 测试条），抗坏血酸可与过氧化氢发生酶(过氧化物酶)促氧化还原反应，减少与还原性电子 介体发生酶促氧化还原反应的过氧化氢含量，导致测得的真实还原电流降低，测量结果产 生负偏差。通常，降低或消除抗坏血酸对电化学试条的干扰主要基于以下几种途径：
[0005] 途径一：间接扣除工作电极表面的干扰电流信号。采用多电极模式(比如三电极结 构的传感器），抗坏血酸在工作电极和背景电极表面同时产生直接氧化电流信号，再将背景 电极的电流信号从工作电极中扣除，达到降低干扰的目的。此法可有效降低抗坏血酸的干 扰，但所用电化学试条需采用多电极工作模式，电极结构复杂，不易制造。此外，该方法目前 仅用于提高以氧化电流为信号的电化学测试条对抗坏血酸的抗干扰能力，不适用于降低抗 坏血酸对以还原电流为检测信号的电化学试条的负干扰。
[0006] 途径二：试条结构包含抗干扰层，如专利cn201110294269.1、cn201210407884.3及 cn201510188547.3中所提到的方案，在常规试条结构上增加一个抗干扰层，抗干扰层与试 条本身的反应层隔离开，使样本通过抗干扰层时，干扰物质（如抗坏血酸）与抗干扰层内的 抗干扰酶(如传统的抗坏血酸氧化酶)反应，使样本内的干扰物质被清除，然后样本再进入 到试条的反应层进行反应，生成待检测物相应的电信号。这种方案使试条的结构变得复杂， 至少在试条的厚度上必须有所增加，同样地制造成本较高，并且在工业生产过程中难于批 量生产，试条质量不好控制。
[0007] 途径三:直接降低工作电极表面的干扰电流信号。直接减少或清除电极表面附近 的抗坏血酸，降低或消除抗坏血酸在电极表面产生干扰电流信号。通常，抗坏血酸在生理环 境中（如血液)带负电，可在工作电极表面覆盖一层带负电的高分子薄膜(如磺化氟代聚合 物naf ion)，利用静电排斥原理将带负电的抗坏血酸与工作电极隔开，减少电极表面抗坏血 酸的量。这种方案在理论上可行，但在实际生产中，由于这种高分子薄膜成本较高，同时对 抗坏血酸的隔离效果难以控制，很难保证每次都可以达到预期效果，以现阶段的技术水平 不具备实用性。
[0008] 途径四：将抗干扰酶与待检测物酶放在一起形成混合酶，如专利 cn200710119127.5中提到的方案，采用传统的抗坏血酸氧化酶参加反应，虽然在理论上可 以达到抗干扰的效果，同时也能采用现有的这种简单结构的试条，使用上也较为简单。但 是，实验结果表明传统抗坏血酸氧化酶加入待检测物酶后，未能明显改善试条对抗坏血酸 的抗干扰能力，同时加入该传统的抗坏血酸氧化酶会产生一些未知的化学反应，对电化学 试条自身的酶反应电流响应信号产生严重干扰(如降低试条精密度，减小电流响应灵敏度， 降低线性范围）。因此，目前在可抛弃的商品化一次性电化学试条中鲜有采用直接混合待检 测物酶与传统的抗坏血酸氧化酶的方法来降低抗坏血酸的干扰。
[0009] 因此，开发一种有效降低或消除抗坏血酸对电化学测试条干扰的方法，提高电化 学测试条的准确度具有重要意义。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明提供了工作电极生物反应物及电极式测试条。该发明在电极式 测试条中采用直接混合目标分析物专一用酶(与待检测物相对应的生物酶)与新型抗坏血 酸氧化酶(n-as0)的方法来降低抗坏血酸的干扰。本发明的抗干扰方法适用于采用单个或 多个工作电极系统的电化学测试条，不仅可降低抗坏血酸对以氧化电流为检测信号的电化 学测试条的干扰，也可降低抗坏血酸对以还原电流为检测信号的电化学测试条的干扰。
[0011] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0012] 本发明提供了一种工作电极生物反应物，包括微生物来源的抗坏血酸氧化酶，与 待检测物相对应的生物酶，以及电子介体。
[0013] 与传统的抗坏血酸氧化酶(as0)相比，本发明中新型抗坏血酸氧化酶（以n-as0表 示)在酶的来源，理化性质以及酶催化反应路径方面有所区别，如表1所示。该n-as0是日本 天野公司出品的一种新型的抗坏血酸氧化酶，其酶来源为微生物体，而传统as0的来源为黄 瓜(植物提取物），两者的分子量、等电点等理化性质上有差别，故两者在分子结构和组成上 存在差异，这种结构和组成上的差异导致了两者对抗坏血酸的酶催化反应路径不同，n-as0 可氧化抗坏血酸产生双氧水，而传统as0的产物为水。同时，本发明研究发现将该n-as0与目 标分析物专一用酶直接混合后所制电化学试条不仅可有效减小抗坏血酸的干扰，而且对目 标分析物专一用酶的酶反应电流响应信号不产生任何干扰(如不影响试条的精密度，不减 小电流响应灵敏度）。该n-as0即可用于降低抗坏血酸对以氧化电流为检测信号的电化学测 试条的干扰，又可用于降低抗坏血酸对以还原电流为检测信号的电化学测试条的干扰：
[0014] -、降低抗坏血酸对以氧化电流为检测信号的电化学测试条的干扰。
[0015] 在以氧化电流为检测信号的电化学测试条中，其氧化电流主要起源于反应生成的 还原型电子介体在正电位下的电化学氧化反应。对于采用单工作电极的此类电化学试条， 在工作电极表面加入新型抗坏血酸氧化酶可将抗坏血酸氧化生成双氧水，而双氧水在电极 表面发生电氧化反应产生正干扰的程度要远小于抗坏血酸，故可降低或消除抗坏血酸对此 类电化学试条的干扰。
[0016] 此外，为一步提高试条的抗干扰能力，可采用双工作电极的电化学试条。第一工作 电极为目标分析物电极，所测电流记为i:，第二工作电极为空白电极，所测电流记为1 2,在第 一和第二工作电极表面均加入新型抗坏血酸氧化酶。实际测量中，第一和第二工作电极表 面的抗坏血酸均被氧化生成双氧水，在正电位下，第一和第二电极表面的双氧水均发生一 定程度的电氧化，产生部分正干扰氧化电流，将第一工作电极电流ιι减去第二工作电极电 流1 2得扣除背景电流信号后的电流1(1 = 1:-12),即可消除该部分正干扰氧化电流，进一步 提高电化学试条对抗坏血酸的抗干扰能力。
[0017] 二、降低抗坏血酸对以还原电流为检测信号的电化学测试条的干扰。
[0018] 在以还原电流为检测信号的电化学测试条中，其还原电流主要起源于反应生成的 氧化型电子介体在负电位下的电化学还原反应。对于此类电化学试条，可采用双工作电极 模式降低抗坏血酸的干扰。同样，第一工作为目标分析物电极，所测电流记为i:，第二工作 电极为空白电极，所测电流记为1 2,在第一和第二工作电极表面均加入新型抗坏血酸氧化 酶。实际测量中，第一和第二工作电极表面的抗坏血酸均被氧化生成双氧水，在负电位下， 第一和第二电极表面的双氧水均发生一定程度的电还原，产生部分正干扰还原电流，将第 一工作电极电流11减去第二工作电极电流12得扣除背景电流信号后的电流i (i = i i-12 )，gp 可消除该部分正干扰还原电流，提高电化学试条对抗坏血酸的抗干扰能力。加入新型抗坏 血酸氧化酶将抗坏血酸的负干扰转变成正干扰，利用双工作电极模式扣除背景信号的方法 降低了抗坏血酸对以还原电流为检测信号的电化学测试条的干扰。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，新型抗坏血酸氧化酶的酶催化反应路径为:l-抗 坏血酸与氧气在所述抗坏血酸氧化酶的催化下生成l-脱氢抗坏血酸和过氧化氢。
[0020] 在本发明提供的一些实施例中，新型抗坏血酸氧化酶的分子量为130000,等电点 为9 · 0，km 常数为4 · 9 x 10-4m。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，与待检测物相对应的生物酶为葡萄糖氧化酶，或 者为羟丁酸脱氢酶和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，电子介体为氧化型电子介体；
[0022] 与待检测物相对应的生物酶为尿酸氧化酶和/或过氧化物酶，或者为胆固醇酯酶 和/或胆固醇氧化酶，电子介体为还原型电子介体。
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