高分辨率振幅反差成像的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及目标成像领域。更特别地，本发明涉及一种利用电子显微术对诸如生 物体之类的柔软物质目标生物体成像的方法和系统。 技术背景
[0002] 在追求对细胞级的生命过程的全面理解时，高分辨率生物成像起着重要的作用。 许多蛋白质被看作在不同复合物的形成中多次被使用的模块。对于大多数复合物来说，其 功能还是未知的。然而，人们认为它们参与了活细胞中的关键过程，并且对组成蛋白质的结 构及其动力学的理解对于在细胞级全面理解生命过程是一个必须步骤。形成在多个联合体 中的复合物的大尺寸以及它们在功能方面的可能的动力学可变性使得大多数所述复合物 无法采用x射线晶体学来进行研究，从而导致低温电子显微术成为结构研究的少数技术之 一。单粒子技术尤其是优选的，因为它们能限制分子的相互作用。
[0003] 在单粒子低温电子显微术的世界中，信条是：生物体是相位目标，其只能利用相衬 显微术来研究。在电子显微术中获得相衬的通常方法是利用负散焦（scherzer聚焦）来补 偿球面像差cs从而产生空间频率的通带，其相移约等于90°。然而，在这种通带中，在低空 间频率的相位传递非常少，这对于关于形状的信息在此范围内的生物体来说是一个问题。
[0004] 一个可能的解决方法是开发一种能够将中心束的相位相对于衍射束转换90°以 上的相位板。然而，尽管全力投入了相位板的开发，迄今为止仍然不能利用相位板来展示清 晰的高分辨率成像。
[0005] -个在低空间频率范围内获得更大相衬的更实用的方法是通过使用超大散焦 (2微米级别）和通过合并几个散焦值并假设成像是线性的来补偿缺失的间隔（missing gap)。但是强散焦的缺点是，在大散焦的情况下，显微镜的空间非相干性将分辨率强力地限 制到4埃的级别。因此，通常认为使用cs校正器对于单粒子低温电子显微术来说价值有限， 尽管其在无机材料的hrem中非常成功。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种适合于柔软物质（例如生物体）的良好成像技术和 系统。
[0007] 本发明的实施例的一个优点是意识到球面像差（cs)校正的高分辨率电子显微术 可以用于柔软物质（例如生物材料）的成像。
[0008] 我们吃惊地发现可以使用柔软物质（诸如生物体）的热漫散射（tds)电子。我们 发现柔软物质的tds电子的信号可以很大，因为其不仅是原子的原子数的函数，还是均方 位移（msd)的函数，其取决于结合能。
[0009] 根据本发明的实施例的优点是提供了方法和系统来进行适合于柔软物质（例如 生物体）的高分辨率电子显微成像，其使用了例如主要包括热漫散射（tds)电子的大角散 射电子。
[0010] 本发明的实施例的一个优点是tds散射是非相干的，因此不会与中心束干涉。 因此产生振幅反差，其可以以最高分辨率成像，例如利用平坦传递函数（flat transfer function)(相移是0)，所述平坦传递函数可以利用球面像差（cs)校正器例如利用极小欠 聚焦来达到。
[0011] 本发明的实施例的一个优点是提供了方法和系统，其在1/埃左右的空间频率提 供最优检测，这是可以利用球面像差（cs)校正器可以在其中实现平坦通带的精确范围。
[0012] 本发明的实施例的一个优点是tds信号容易理解并且与"质量-厚度"成线性，因 此非常适合于断层扫描成像。
[0013] 本发明的实施例的一个优点是尤其针对该成像技术优化的环形暗场物镜孔径可 以用于选择热漫散射电子。在某种意义上，该方法可以与haadf stem相比，而具有hrem的 所有优点。
[0014] 上述目标通过根据本发明的一种方法和设备来完成。
[0015] 本发明涉及一种用于进行目标的高分辨率电子显微术的方法，所述方法包括利用 具有球面像差校正的电子显微镜照射目标，在以原子水平分辨率在目标上散射的热漫散射 电子的频带内，所述球面像差校正具有基本上恒定的传递函数，其特征在于所述方法包括 检测在所述目标上散射的热漫散射电子，然后基于所检测的热漫散射电子获得柔软物质目 标的图像。
[0016] 在本发明的实施例中引用基本上恒定的传递函数时，在平均值的像差为微米或更 低级别的情况下引用。
[0017] 根据本发明的实施例，所研究的目标可以是柔软物质目标，尽管实施例并不限于 此。本发明的实施例的一个优点是利用所公开的方法可以研究蛋白质质。因此一个优点是 热漫散射在1埃左右，这在cs校正电子显微镜可以达到的范围内。所述方法还可以有利地 用于研究聚合物。然而，所述方法还可以适用于无机材料。
[0018] 本发明的实施例的一个优点是可以利用在目标上散射的热漫散射电子来是所述 目标成像。所述目标可以是柔软物质。在一个实施例中，它可以是蛋白质质。本发明的实施 例利用了这样一个事实，即发明人发现在原子水平分辨率对柔软物质例如生物体成像时， 热漫散射是有用的。
[0019] 在柔软物质目标上散射的热漫散射电子的频带可以包括0.5 a-1到1.0 a·1的范 围。所述照射因此可以利用一个小散焦来进行。所述照射可以利用一个小欠聚焦来进行。
[0020] 像差校正cs可以是几微米的级别，而对应的散焦d可以是几纳米的级别。像差 校正和散焦的值可以如下选择。对于想要达到的分辨率r，可以确定像差校正为（1.6r)4/ ((l) 3)，其中l为波长。对应的散焦d可以确定为cs. l的1、2次平方根。
[0021] 所述照射可以利用环形暗场物镜孔径来进行。利用环形暗场物镜孔径来成像可以 包括利用具有基本上环孔形状的环形暗场物镜孔径来成像，其中所述环孔形状具有内径和 外径，所述内径和外径对应于在生物体上散射的热漫散射电子的频带来选择。
[0022] 所述频带可以在0. 5埃（-1)到1埃（-1)之间。在一个实施例中，所述频带可选 为0.5/σ到l/σ之间，其中σ为原子的平均热位移。
[0023] 所述柔软物质目标可以为生物体。
[0024] 进行高分辨率电子显微术可以包括进行断层扫描成像。
[0025] 获得图像可以包括将每个原子的非相干贡献（incoherent contribution)独立地 加入到最终的图像中。
[0026] 基于所检测到的热漫散射电子获得柔软物质的图像包括基于每个原子的非相干 贡献获得独立的子图像。
[0027] 所述方法可以包括三维柔软物质目标粒子的断层扫描成像，其中使用相同的成像 条件在同一成像步骤中使粒子成像，所述粒子相对于成像系统在目标中具有不同的深度位 置从而导致小于预定值的散焦。
[0028] 所述方法可以包括考虑到不同的散焦值，使用不同的成像条件在不同的成像步骤 中对粒子成像，所述粒子相对于成像系统在目标中具有不同的深度位置从而导致大于预定 值的散焦。
[0029] 本发明还涉及一种在原子水平分辨率进行柔软物质目标的高分辨率电子显微术 的系统，所述系统包括球面像差校正器，其在所述系统中在散射在所述柔软物质目标上的 热漫散射电子的频带内诱导基本上恒定的传递函数，其特征在于所述系统还包括适于检测 在柔软物质上散射的热漫散射电子的检测器，和基于所检测的热漫散射电子获得所述柔软 物质目标的图像的图像处理器。
[0030] 电子显微镜在0.5 a·1到1.0 a·1之间可以具有基本上恒定的传递函数。
[0031] 电子显微镜还可以进一步包括环形暗场物镜孔径。
[0032] 所述环形暗场物镜孔径可以是具有内径和外径的环孔形状，所述内径和外径对应 于在柔软物质目标上散射的热漫散射电子的频带来选择。
[0033] 本发明还涉及用于电子显微镜系统中的环形暗场物镜孔径，所述环形暗场物镜孔 径是具有内径和外径的环孔形状，所述内径和外径对应于在柔软物质目标上散射的热漫散 射电子的频带来选择。
[0034] 本发明还涉及上述系统的使用，用于对柔软物质目标成像。
[0035] 本发明还涉及用于生物体的上述系统的使用。
[0036] 本发明进一步涉及使用上述方法获得的电子显微镜图像。
[0037] 本发明特别的和优选的方面在所附的独立和从属权利要求中提出。从属权利要求 中的特征可以恰当地与独立权利要求中的特征和其它从属权利要求中的特征结合，而并不 仅如权利要求中明确提出的那样。参照后面描述的实施例，本发明的这些和其它方面是显 而易见的并通过参照后面描述的实施例来阐明。
【附图说明】
[0038] 图1表示根据本发明的实施例的一个用于电子显微术的系统。
[0039] 图2表示在最佳散焦下传递函数的虚部，其表示比较材料可以用于阐明本发明的 实施例的特征。
[0040] 图3表示在强欠聚焦下传递函数的虚部，其表示比较材料可以用于阐明本发明的 实施例的特征和优点。