1.本发明涉及乳制品技术领域，特别是涉及一种巴氏杀菌乳杀菌温度的鉴定方法及应用。
背景技术：
2.巴氏杀菌乳加工条件相对uht灭菌乳而言较为温和，能更好的保留牛奶中天然存在的活性物质，因此在乳业发达的地区，尤其是发达国家占有很大的份额。
3.目前，国际组织和世界各国均没有颁布用于牛奶杀菌温度的鉴定标准，因此，有必要开发一种鉴定巴氏杀菌乳杀菌温度的方法，指导巴氏杀菌乳的生产，保证巴氏杀菌乳质量，保障消费者的权益，促进乳品行业的健康发展。
技术实现要素：
4.本发明的目的是提供一种巴氏杀菌乳杀菌温度的鉴定方法及应用。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：生乳（raw milk），也称为生鲜乳，是指从健康奶畜挤下的经过或不经过过滤和冷却，但未经过任何加热和其他除菌处理的常乳。巴氏杀菌乳指的是以新鲜牛乳为原料，经过净乳（过滤和离线）、冷却、标准化、均质、巴氏杀菌、冷却和灌装而成的饮用乳。
6.一种巴氏杀菌乳杀菌温度的鉴定方法，包括以下步骤：（1）测定生鲜乳中β-乳球蛋白与糠氨酸的含量；（2）检测巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白与糠氨酸的含量并计算与生鲜乳中相应物质的含量差；（3）依据预测模型计算巴氏杀菌乳的杀菌温度；式中，x1：巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白与生鲜乳中β-乳球蛋白的含量差，单位mg/l；x2：巴氏杀菌乳中糠氨酸与生鲜乳中糠氨酸的含量差，单位mg/100g蛋白质。
7.本发明将“巴氏杀菌温度”具体定义为“高温（72.5℃～120℃）短时间（保持15s）巴氏杀菌乳杀菌工艺中所采用的杀菌温度”。本发明方法中的巴氏杀菌乳中不添加营养强化剂，或仅添加矿物质和/或维生素。
8.其中，所述β-乳球蛋白含量的测定方法包括以下步骤：（1）采样：取不少于200 ml液态奶作为实验样品，将样品在0℃～4℃条件下保存；（2）上机液的制备：吸取2 ml试样，置于50 ml离心管中，加入15 ml超纯水，混匀；往离心管中加入35 ~ 45μl冰醋酸，摇匀，调节ph为4.6；将离心管置于高速离心机中，于10000 rpm、4℃条件下离心10 min；取出离心管，弃去上部的脂肪和底部的沉淀，用注射器吸取中间的清液，过0.22 μm的微孔滤膜，以备上机检测；（3）β-乳球蛋白含量的测定1）色谱参考条件色谱柱：symmetry c4 色谱柱，4.6 mm x 250 mm，300
å
，5
ꢀµ
m粒径；或者相当者；
柱温：30℃；检测器：pda检测器；进样体积：50 μl；流动相：乙腈为流动相a；0.1 %三氟乙酸溶液为流动相b；洗脱梯度如下表：时间（min）流速ml/min乙腈（%）0.1%三氟乙酸溶液（%）01.0307051.05545101.06040121.03070161.030702）定量β-乳球蛋白含量以浓度c表示，数值以mg/l表示，按公式（1）计算：
ꢀ……………………
(1)式中：c：样品中β-乳球蛋白的含量，单位为mg/l；ci：上机液中β-乳球蛋白的含量，单位为mg/l；v1：牛奶样品的体积，单位为ml；v2：超纯水的体积，单位为ml。
9.所述β-乳球蛋白含量的测定方法精密度控制要求为：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的20%。
10.其中，所述糠氨酸含量的测定方法包括以下步骤：（1）采样：取不少于200 ml液态奶作为实验样品，将样品在0℃～4℃条件下保存；（2）水解液的制备：吸取2 ml试样，置于密闭耐热试管中，加入6 ml的10.6 mol/l盐酸溶液，混匀，往试管中缓慢通入所述高纯度氮气1 min～2 min，密闭试管，将试管置于干燥箱，在110℃下加热1 h后，轻轻摇动试管，继续加热直至加热23 h～24 h；加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后过滤，制得水解液；（3）水解液中蛋白质含量的测定：吸取2 ml步骤（2）制得的水解液，按gb/t 5009.5测定试样溶液中蛋白质含量；（4）水解液的纯化：将c18萃取柱安装在注射器上，分别用5 ml甲醇和10 ml水润湿萃取柱；吸取0.500 ml步骤（2）中水解液于萃取柱，用注射器缓慢推入c18萃取柱内；吸取3 mol/l 盐酸溶液缓慢洗脱萃取柱中的样品至3 ml；（5）糠氨酸含量的测定：采用hplc法和/或uplc法测定；（6）糠氨酸含量计算：糠氨酸含量以质量分数w计，数值以mg/100 g蛋白质表示，按公式(2)计算：
ꢀ……………………
(2)
℃。不仅可以指导巴氏杀菌乳生产、保证巴氏杀菌乳质量，为巴氏杀菌乳监管奠定技术基础，而且可以推动我国在该领域的技术创新处于国际先进水平。
16.本发明的鉴定方法进一步提高了乳制品检测方法的权威性，也在提高巴氏杀菌奶质量、保障消费者知情权、促进我国奶业健康发展等方面发挥重要的作用。
17.下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的巴氏杀菌乳杀菌温度的鉴定方法及应用作进一步说明。
附图说明
18.图1为不同加工温度的巴氏杀菌乳与生鲜乳中β-乳球蛋白含量差值与加工温度的拟合图；图2为不同加工温度的巴氏杀菌乳与生乳中糠氨酸含量差值与加工温度的拟合图。
具体实施方式实施例1 糠氨酸含量的测定方法
19.牛奶在加热过程中发生梅拉德反应，使蛋白质和糖生成糠氨酸（ε-n-2-呋喃甲基-l-赖氨酸）。试样经盐酸水解后测定蛋白质含量，水解液经c18萃取，用高效液相色谱（hplc）或超高效液相色谱（uplc）在紫外（280 nm）检测器下对糠氨酸样品进行分析，以外标法定量糠氨酸。最后计算每百克蛋白质中糠氨酸的含量。需要说明的是，本发明对糠氨酸含量的测定方法中仅使用确认为分析纯的试剂和gb/t 6682中一级水。
20.（1）试剂甲醇(ch3oh)：色谱纯。
21.3 mol/l盐酸溶液：在7.5 ml水中加入2.5 ml浓盐酸（12 mol/l），混匀。
22.10.6 mol/l盐酸溶液：在12 ml水中加入88 ml浓盐酸（12 mol/l），混匀。
23.0.1%三氟乙酸溶液：吸取1 ml三氟乙酸(色谱纯)溶于水中，定容至1 l，超声波脱气35 min。
24.6 g/l kcl溶液(m/v)：准确称量6 g kcl溶于部分水中，定容至1 l，过0.45 μm水相滤膜，超声波脱气35 min。
25.糠氨酸(furosine)( ε-n-(2-呋喃甲基)-l-赖氨酸)标准贮备溶液：将糠氨酸标准物按其纯度换算后，用3 mol/l盐酸溶液配制成200 μg/ml的标准贮备溶液，-20
°
c条件下可贮存24个月。
26.糠氨酸标准工作溶液：微量移液器吸取250 μl标准贮备溶液于25 ml容量瓶，以3 mol/l盐酸溶液定容，配制成2 μg/ml糠氨酸标准工作溶液。
27.高纯度氮气：99.99 ％。
28.（2）仪器
29.高效液相色谱仪：配有梯度洗脱系统及紫外检测器或二极管阵列检测器。
30.凯氏定氮仪。
31.c18萃取柱：柱容量500 mg。
32.干燥箱：110℃
ꢀ±
2℃。
33.密封耐热试管：容积为20 ml。
34.注射器：10 ml。
35.容量瓶：容积分别为25 ml和1 l。
36.超高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
37.有机相滤膜：0.45 μm。
38.水相滤膜：0.45 μm。
39.糠氨酸含量的测定步骤如下：（1）采样：取不少于200 ml液态奶作为实验样品，将样品在0℃～4℃条件下保存。
40.（2）水解液的制备：吸取2 ml试样，置于密闭耐热试管中，加入6 ml的10.6 mol/l盐酸溶液，混匀，往试管中缓慢通入所述高纯度氮气1 min～2 min，密闭试管，将试管置于干燥箱，在110℃下加热约1 h后，轻轻摇动试管，继续加热直至加热23 h～24 h。加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后过滤，制得水解液。
41.（3）水解液中蛋白质含量的测定：吸取2 ml步骤（2）制得的水解液，按gb/t 5009.5测定试样溶液中蛋白质含量。
42.（4）水解液的纯化：将c18萃取柱安装在注射器上；分别用5 ml甲醇和10 ml水润湿萃取柱，保持萃取柱湿润状态；吸取0.500 ml步骤（2）中水解液于萃取柱，用注射器缓慢推入c18萃取柱内；吸取3 mol/l 盐酸溶液缓慢洗脱萃取柱中的样品至3 ml。
43.（5）糠氨酸含量的测定：采用以下两种方法测定。（a）hplc法；（b）uplc法。
44.（a）hplc法：1) 色谱参考条件色谱柱：c18硅胶色谱柱，250 mm
×
4.6 mm，5 μm粒径，或相当者。
45.柱温：32℃。
46.流动相：0.1%三氟乙酸溶液为流动相a，甲醇为流动相b。
47.洗脱梯度：见表1。
48.表1 洗脱梯度序号时间min流量ml/min流动相a%流动相b%1－1.00100.00.0216.001.0086.813.2316.501.50100.00.0430.001.000.0100.02) 测定利用流动相a和流动相b的混合液（50∶50）以1 ml/min的流速平衡色谱系统；注入20 μl～50 μl的3 mol/l盐酸溶液平衡柱子，以检测溶剂的纯度；注入10 μl待测溶液（即步骤（4）得到的纯化后的水解液）测定糠氨酸含量。
49.（b）uplc法1）色谱参考条件色谱柱：waters acquity uplc
®
hss t3色谱柱1.8 μm（100 mm
×
2.1 mm），或相当者。
50.柱温：30 ℃。
51.流动相：6 g/l kcl溶液为流动相a，甲醇为流动相b，纯水为流动相c。
52.洗脱条件：流动相a，0.4 ml/min。
53.2) 测定分别利用流动相b、c、a以0.4 ml/min的流速依次平衡色谱系统。注入2 μl～5 μl的3 mol/l盐酸溶液平衡柱子,以检测溶剂的纯度。注入2 μl待测溶液（即步骤（4）得到的纯化后的水解液）测定糠氨酸含量。
54.（6）糠氨酸含量计算结果：糠氨酸含量以质量分数w计，数值以毫克每百克蛋白质（mg/100 g蛋白质）表示，按公式(1)计算：
ꢀ……………………
(1)式中：w：样品中糠氨酸含量，单位为毫克每百克蛋白质(mg/100 g蛋白质)；a
t
：测试样品中糠氨酸峰面积的数值；a
std ：糠氨酸标准溶液中，糠氨酸峰面积的数值；c
std ：糠氨酸标准溶液的浓度，单位为mg/l；d：测定时稀释倍数(d=6)；m：样品水解液中蛋白质浓度，单位为克每升(g/l)。
55.计算结果保留至小数点后一位。
56.糠氨酸含量的测定方法精密度控制如下：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的20%。
57.hplc和uplc检测方法的检测限和定量限分别如表2所示。
58.表2 糠氨酸含量测定的hplc和uplc法的检测限和定量限
检测方法上样量(μl)最低检出浓度(mg/l)最低定量浓度(mg/l)检出限(mg/100g蛋白质)定量限(mg/100g蛋白质)hplc100.050.11.02.0uplc20.010.10.20.4
59.实施例2 β-乳球蛋白含量的测定方法
60.牛奶中酪蛋白及变性的乳清蛋白在ph = 4.6条件下可以等电沉淀。离心和过滤可以分离酸溶的乳清蛋白。酸溶乳清蛋白中的β-乳球蛋白可以通过反相高效液相色谱（rp-hplc）在紫外紫外（280 nm）检测器下对样品进行分析，以外标法定量β-乳球蛋白的含量。需要说明的是，本发明中对β-乳球蛋白的测定方法中仅使用确认为分析纯的试剂和gb/t 6682中一级水。
61.（1）试剂乙腈（c2h3n）：色谱纯。
62.三氟乙酸（cf3co2h）：色谱纯。
63.醋酸（c2h4o2）：分析纯。
64.β-乳球蛋白标准中间工作溶液：将β-乳球蛋白标准物质按其纯度换算后，用超纯水配置成2.5 mg/ml的标准工作溶液，4℃条件下可贮存1周。
65.β-乳球蛋白标准工作溶液：定量微量移取β-乳球蛋白标准中间工作溶液于2 ml容量瓶中，用超纯水定容，分别配制成5、10、20、50、100、200、500 mg/l β-乳球蛋白标准工作溶液。
66.（2）仪器高效液相色谱仪：配有梯度洗脱系统及紫外检测器或二极管阵列检测器。
67.日立高速离心机：配有制冷功能。
68.容量瓶：容积为2 ml。
69.微孔滤膜：有机、水相通用，0.22 μm。
70.注射器：1 ml。
71.离心管：50 ml。
72.β-乳球蛋白含量的测定步骤如下：（1）采样：取不少于200 ml液态奶作为实验样品，将样品在0℃～4℃条件下保存。
73.（2）上机液的制备：吸取2 ml试样，置于50 ml离心管中，加入15 ml超纯水，混匀。往离心管中加入约35 ~ 45μl冰醋酸，摇匀，调节ph为4.6。将离心管置于高速离心机中，于10000 rpm、4℃条件下离心10 min。取出离心管，弃去上部的脂肪和底部的沉淀，用注射器吸取中间的清液，过0.22 μm的微孔滤膜，以备上机检测。
74.（3）β-乳球蛋白含量的测定：1）色谱参考条件色谱柱：symmetry c4 色谱柱, 4.6 mm x 250 mm， 300
å
，5
ꢀµ
m粒径，或者相当者。
75.柱温：30℃。
76.检测器：pda检测器。
77.进样体积：50 μl。
78.流动相：乙腈为流动相a；0.1 %三氟乙酸溶液为流动相b。
79.洗脱梯度：见表3。
80.表3 β-乳球蛋白含量测定梯度洗脱程序时间（min）流速ml/min乙腈（%）0.1%三氟乙酸溶液（%）01.0307051.05545101.06040121.03070161.030702）定量β-乳球蛋白含量以浓度c表示，数值以毫克每升（mg/l）表示，按公式（2）计算：
ꢀ……………………
(2)式中：c：样品中β-乳球蛋白的含量，单位为毫克每升（mg/l）；c
i ：上机液中β-乳球蛋白的含量，单位为毫克每升（mg/l）；v
1 ：牛奶样品的体积，单位为毫升（ml）；v2 ：超纯水的体积，单位为毫升（ml）。
81.计算结果保留至小数点后两位。
82.β-乳球蛋白含量的测定方法精密度控制如下：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，在重现性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的20%。
83.本发明中测定β-乳球蛋白含量的hplc方法的检出限为1.67 mg/l。
84.实施例3 巴氏杀菌乳杀菌温度的鉴定方法
85.本发明通过检测糠氨酸和β-乳球蛋白两个指标对巴氏杀菌乳的杀菌温度进行鉴定，其中糠氨酸的定量与乳源性蛋白有关。因此，凡是产品中添加了非乳源性蛋白的物质，均可能对鉴定结果造成干扰。我国现行的液态奶的产品标准包括《巴氏杀菌乳》、《灭菌乳》、《调味奶》和《ad钙奶》，市场上的品种更多，包括纯牛乳、调味乳、维生素强化乳、矿物质强化乳以及加入果汁、鸡蛋等各类原料的产品。同时，gb14880-2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》规定可在调制乳中添加乳铁蛋白和酪蛋白磷酸肽，这两种含有蛋白质的成分在加热过程中也可产生糠氨酸。基于上述情况，本发明的适用范围进一步明确为：本发明适用于不添加营养强化剂或仅添加矿物质、维生素的巴氏杀菌乳。
86.下面根据生乳及巴氏杀菌乳中糠氨酸及β-乳球蛋白含量值对不添加营养强化剂，或仅添加的矿物质和/或维生素的巴氏杀菌乳的杀菌温度进行鉴定。
87.（一）生乳、不同杀菌温度巴氏杀菌乳中糠氨酸、β-乳球蛋白含量采用不同的巴氏杀菌温度，利用巴氏杀菌乳生产线（某乳品加工厂）对生鲜乳进行加工，并对不同条件下生产的巴氏杀菌乳中糠氨酸和β-乳球蛋白的含量依据实施例1-2的测定方法进行检测。
88.生鲜乳及不同条件下生产的巴氏杀菌乳中糠氨酸和β-乳球蛋白的含量结果如表4，结果显示随着加工温度的升高，糠氨酸含量逐渐升高，β-乳球蛋白的含量逐渐减少；且加工温度越高条件下生产的巴氏杀菌乳中糠氨酸及β-乳球蛋白含量与生乳中对应值差异越大。
89.表4 生乳及不同杀菌温度条件下生产的巴氏杀菌乳中糠氨酸及β-乳球蛋白含量
90.（二）巴氏杀菌乳杀菌温度鉴定方法
91.图1为不同温度巴氏杀菌乳与生鲜乳中β-乳球蛋白含量差值与加工温度的拟合
图。图2为不同温度巴氏杀菌乳与生鲜乳中糠氨酸含量差值与加工温度的拟合图。综合图1与图2，得到不同温度巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白及糠氨酸与生鲜乳中对应物质的差值关于温度的拟合曲线为（式中：x
1 表示与生鲜乳相比β-乳球蛋白的含量差，单位mg/l；x
2 表示与生鲜乳相比糠氨酸的含量差，单位mg/100 g蛋白质），r2=0.994，可用于75℃～120℃范围内巴氏杀菌乳杀菌温度的预测。
92.应用实例 某乳品加工厂生产的巴氏杀菌乳杀菌温度的鉴定（模型验证）
93.将某乳品加工厂生产的一批巴氏杀菌乳进行模型验证，验证样品一共14份，包括1批次生乳，从60℃到120℃相差5℃的梯度温度共13批次，其中正常巴氏杀菌乳为10份。
94.参阅表5，其为巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白及糠氨酸含量，以及与生鲜乳中相应物质的含量差。表5结果表明，随着加热温度的升高，糠氨酸含量逐渐升高，β-乳球蛋白的含量逐渐减少；且加工温度越高条件下生产的巴氏杀菌乳中糠氨酸及β-乳球蛋白含量与生乳中对应值差异越大。并且依据实施例3所建立的预测模型，根据不同巴氏杀菌乳中β-乳球蛋白和糠氨酸与生乳中相应含量的差值，预测得到的杀菌温度请参阅表5。
95.表5 巴氏杀菌乳中糠氨酸及β-乳球蛋白含量
96.表5结果表明，本发明所建立的预测模型可以在75℃～120℃范围内准确的预测巴氏杀菌乳的杀菌温度，精度为
±
1℃。
97.以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。