专利名称：通过托酚酮与铜cu(ⅱ)形成复合物来测定托酚酮的方法
技术领域：
本发明涉及分析化学和从细胞培养物中产生重组蛋白质的领域。本发明设计了一种用于检测分析量的托酚酮的方法，该托酚酮是动物细胞培养中的细胞培养添加物并可能污染从这种细胞培养上清液中纯化的产物蛋白。
托酚酮，2-羟基-2，4，6-环庚三烯-1-酮是如ep-610 474b1所述，加入无蛋白的动物细胞培养基以允许细胞摄取铁的熟知的铁螯合剂。就此意义而言，托酚酮很像细菌的天然铁载体。其优点在于合适的可逆铁鳌合性能和无毒性，即在相关剂量下它不与任何细胞功能相互作用也不对动物细胞的生长产生不利影响。
作为合成的化学物质，从补加了托酚酮的培养物中获得的任何生物药学产物蛋白均需测试纯化过程中带入的托酚酮的痕量污染物。需要对托酚酮具有足够分辨率的灵敏而可靠的分析方法。
本发明的目标之一是设计用于测定细胞培养物上清液或蛋白质溶液，特别是含有富集至1mg/ml或更高浓度的产物蛋白的蛋白质溶液的托酚酮的分析方法。
本发明用于测定动物细胞培养物上清液或含有富集了产物蛋白的蛋白质溶液的托酚酮或其衍生物的方法解决了该目标，所述方法包括a.将蛋白质与托酚酮或其衍生物分离，在该步骤之前或之后进行b.使托酚酮或其衍生物与cu(ii)离子在溶液中形成复合物，和c用疏水固定相和流动相，优选可与水混溶的流动相通过反向hplc测定托酚酮或其衍生物，其中所述流动相含有cu(ii)离子和离子对试剂。
附图举例说明了本发明可能的实施方案。附图显示了
图1a以0.1％cuso4/0.3％hsa/10％乙腈为流动相在ace c18 2.1mm rphplc柱上分析的托酚酮标准品(2.0μg/ml)。
图1b以0.1％cuso4/0.1％tfa/10％乙腈为流动相在ace c18 2.1mmrp hplc柱上分析的托酚酮标准品(2.0μg/ml)。
图1c以0.1％cuso4/0.1％msa/10％乙腈为流动相在ace c18 2.1mmrp hplc柱上分析的托酚酮标准品(2.0μg/ml)。
图1d以0.1％cuso4/0.3％hsa/10％乙腈为流动相在ace c18 2.1mm rphplc柱上分析的托酚酮标准品(0.1μg/ml)。上面一幅托酚酮标准品。下面一幅流动相。
图2a无加料的(spiked)igg，批号11859和对照缓冲液的色谱图的例子。
图2b托酚酮加料(10ng/ml)的igg，批号11859和加料对照缓冲液的色谱图的例子。
图2c托酚酮加料(100ng/ml)的igg，批号11859和加料对照缓冲液的色谱图的例子。
托酚酮是2-羟基-2，4，6-环庚三烯-1-酮。托酚酮的合成描述于doering等，j.am.chem.soc.(1951)，73828-838。衍生物的合成描述于，例如us 3,134768和jp44031595b。根据本发明，合适的托酚酮衍生物是能鳌合亚铁或铁离子并可在动物细胞培养物中用作膜可渗透性铁载体的铁螯合剂而不对细胞功能产生不利影响，即无毒副作用的衍生物。本发明不包含的毒性托酚酮衍生物的例子是，例如特异性扰乱基础细胞功能从而对细胞高度毒性的秋水仙碱和去甲秋水仙碱；不能使用它们或用活细胞来测试它们作为铁载体的性能。为具有螯合剂性能，根据本发明，合适的托酚酮衍生物优选与上述定义和以下结构i一致 其中r1、r2、r3、r4可单独(或组合)为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳链烯基(alakenyl)、芳炔基(alakynyl)、杂芳基、杂芳烷基、杂芳链烯基(heteroaralkenyl)或杂芳炔基(heteroaralkynyl)，前提是r1＝r2＝r3＝r4＝h排除的情况，这是托酚酮本身而非其衍生物。r1-r4基团还可由，例如卤素、酮、酰氨基官能团取代，这种取代不能干扰必要的两性铁载体所需的膜渗透性。“结合”意味着基团r1、r2、r3和/或r4可形成前述化学类型的环状取代基。
在还要优选的实施方案中，本发明的方法仅测定托酚酮。如此排除了托酚酮衍生物。托酚酮的铁螯合性能为人熟知，但其cu螯合性能还不了解。本说明书所述不明确指出涉及托酚酮衍生物的测定方法的所有优选实施方案和样品制备方面同样适用于该优选的实施方案。
本领域的技术人员熟知反向hplc，例如常规应用于肽的hplc。在反向hplc中，固定相由具有高机械强度的惰性支持材料构成，例如基于二氧化硅的、基于氧化铝包衣的或甲基丙烯酸聚合物支持材料。就反向而言，疏水功能基团共价连接于支持或基质材料。这种反向功能基团可是，例如丁基、氰基、二乙烯基苯基、苯基、己基、癸基、十二烷基、十八烷基。也可使用称为屏蔽的或包埋的，具有足够疏水性和分辨率性能的技术人员熟知的反向柱。提供hplc的固定相的合适hplc柱可容易地购自，例如supelco/fluka chemie，瑞士或waters/ma，美国。
反向hplc固定相优选由用链烷基(alkanyl)，优选用c10-c20链烷基，最优选用c18-十八烷基链烷基功能化的基质构成。还要优选的是与优选功能基团相连的基质材料是二氧化硅。因此，本发明优选的固定hplc相是烷基硅烷、更优选c10-c20烷基硅烷、最优选c18-十八烷基-硅烷。当用于本发明的方法连同离子对试剂，特别是用于下述本发明方法的优选实施方案时，这些优选的实施方案在托酚酮峰的分辨率、柱容量和避免由于固定相吸附而导致灵敏度丧失的方面特别有利。
本发明的离子对试剂是还要至少一种可离子化的羧酸基团的试剂，该基团可至少暂时性地与cu-托酚酮复合物结合同时与反向固定相具有一定亲和力，从而将cu-托酚酮复合物维持于固定相上。简言之，本发明的离子对试剂定义为具有羧基并增加20℃下在有0.1％(w/v)cuso4时，10％乙腈水溶液中的cu(ii)-托酚酮复合物在反向c18hplc柱上的保留时间。
优选离子对试剂的疏水性强于三氟乙酸(tfa)。当需要用于反向hplc的离子对试剂时，tfa常规用于肽的反向hplc并几乎认为是普遍适用的黄金标准。疏水性更强的离子对化合物的特征在于(以其酸形式)和tfa相比，其介电材料常数的数值较低。合适的离子对试剂是，例如邻苯二甲酸四丁基铵、七氟丁酸、甲磺酸、己磺酸或它们的盐。更优选离子对试剂具有等于甲磺酸和己磺酸的疏水性或在二者的疏水性范围内，所述疏水性由其特定的介电常数数值来判断。最优选离子对试剂选自丁磺酸、戊磺酸和己磺酸或它们的盐，其中烷基取代基可是支链或非支链的，优选非支链的。在特别优选的实施方案中，离子对试剂是己磺酸、更优选正己磺酸、最优选以流动相中0.1-5％(w/v)的浓度使用。
出于本发明的目的，可用tfa、甲磺酸和己磺酸作为参考物质，通过产生给定的本发明反向hplc实施方案的保留指数排名来更精确地定义用于反向层析的疏水性能。这种指数系统用于，例如定义溶剂的极性(极性指数，l.r.snyder，j.chromatogr.，92，223(1974)，j.chromatogr.sci.，16，223(1978))并且可应用于合适的环境来定义离子对试剂的极性/疏水性。
离子对试剂的浓度优选0.01-10％(w/v)、更优选0.1-5％(w/v)、最优选0.11-1％(w/v)。在特别优选的实施方案中，己磺酸以0.1-0.5％(w/v)浓度使用。在还要特别优选的实施方案中，上述浓度范围内的己磺酸与烷基硅烷固定相，优选c18-十八烷基-固定相联用。
hplc流动相宜为极性的，水混溶的液体。流动相优选含有1-30％(v/v)、更优选5-20％(v/v)乙腈。乙腈至少与一种其它极性溶剂混合。除了所述其它极性溶剂和乙腈之外，流动相还可含有其它溶剂。
其它极性溶剂优选水、更优选流动相含有至少60％(v/v)水。
为促进cu(ii)-托酚酮复合物形成并避免hplc时该可逆复合物解离，流动相优选含有cuso4作为cu(ii)离子源。流动相中cuso4或cu(ii)离子的通常浓度更优选在0.05％-0.2％(w/v)范围内，最优选是0.7-0.14％(w/v)。
如上所述，优选从蛋白质溶液中测定托酚酮或其衍生物。更优选从其中产物蛋白质的浓度富集至lmg/ml或更高的蛋白质溶液中测定。
在其它优选的实施方案中，通过用cu(ii)盐，优选cuso4沉淀托酚酮或其衍生物和蛋白质并回收该沉淀物，然后通过超滤从沉淀物中除去蛋白质来实现与蛋白质相互分离。超滤可用蛋白质或生物化学家熟知的装置，即amicon滤膜或使用这种膜的旋转过滤器进行。该优选的实施方案可非常有效地、完全地从原始样品中回收托酚酮或其衍生物，同时和分离在一个步骤中形成复合物。更重要的是，该方法除去了用于保存非变性蛋白质的缓冲液中通常存在的干扰性离子种类(磷酸盐、氯化物)，所述离子种类可干扰托酚酮的hplc测定。样品无需为hplc操作而脱盐。此外，在hplc上样前无需脱盐。然而，本领域常规用于蛋白质沉淀的硫酸铵沉淀相反会导致托酚酮回收不完全。可用0.5-10％cu(ii)-盐、更优选1-5％(w/v)cu(ii)盐方便地进行沉淀。
实验测试了几种制备样品的途径，所述样品从以标准pbs缓冲液(磷酸缓冲生理盐水)配制的、加料2000ng/ml托酚酮的、纯化、完整的igg抗体溶液制备。细胞培养基通常从细胞培养开始时含有约10μm托酚酮。
通过比较制备相同样品的不同方法，确定了从原始样品得到最高产量的方法。现在更详细地描述用cu(ii)沉淀的最佳方式。
用来源于nso细胞培养上清液的粗纯化igg抗体的真实生产样品实施该方法也表现良好，所述细胞培养生长于30μm托酚酮的环境中。上清液仅用蛋白质a-琼脂糖层析处理；测试了加料和未加料的样品。
所检测的托酚酮样品制备示意图
在ultravap氮气干燥单元干燥后，加工过的样品在200μl用于上述rphplc分析的流动相中复水还原。spe重力-驱动的strata×3ml用聚苯乙烯二乙烯基苯固体聚合物制造的固相萃取盒，用500μl乙醇和500μl 5mmh2so4预活化。
1.cuso4样品沉淀按上述配制的标准托酚酮溶液与cuso4溶液混合至终浓度为2％cuso4(w/v)。以15000×rcf离心15分钟除去沉淀的盐。
加入400μl水来平衡microcon(millipore，usa)10kda mw-截断值500μl-过滤器(ym-10)，接着于13000×rcf离心40分钟。然后样品上清液应用于microcon过滤器。过滤器以13000×rcf离心40分钟。然后用100μl水洗涤过滤器并合并滤液。合并的滤液在氮气环境下于玻璃小瓶中干燥，在200μl流动相中复水还原并用rp hplc分析。该方法得到84％的产率。总体上，就用100-2000ng/ml托酚酮加料的样品而言，该平均回收率证实可重现；例如就用20-40ng/ml范围的非常低量的托酚酮加料的样品而言，回收率可高达94％。
或者，进行该方法无需干燥样品，在最优方法中证实干燥不是必需的。滤液纯粹用rp hplc分析。
以上所述任选建立的方法得到＜20％(固相萃取)和65％(microcon超滤)的平均回收率。
2.rp hplc用advanced chromatography technologies ace c18 2.1mm柱作为固定相和0.1％cuso4(w/v)/0.3％己磺酸/10％乙腈水溶液流动相，在等度洗脱(isocratic elution)条件下，于25℃以流速0.2ml/分钟，242nm检测和100μl进样量进行rp hplc。hplc系统是包括真空脱气器、双泵、恒温柱温箱和自动进样器，连同a6.04或更高版本的chemstation软件的agilent 1100hplc系统或相当的系统。
以该方法分析的托酚酮标准品的洗脱曲线示于图1a和1b。图1b和1c显示除了使用不同的离子对试剂外(替代为tfa和msa，第4部分)，相同流动相和固定相的洗脱曲线。
图2a-2b显示来源于大规模生产的完全igg抗体的处理批的分析。抗体仅通过蛋白质a-琼脂糖层析而部分纯化。其它解释见附图的标题。
对ace c-18柱和hamilton[公司位置？]prp聚苯乙烯-二乙烯基苯4.6mm反向柱进行了比较。由于聚苯乙烯-二乙烯基苯固定相对水溶液的耐受使得可用较高极性的流动相(与c18柱相比)从而可能增加托酚酮洗脱的保留时间，再次检测以前评价过的prp-1聚合物柱使用cuso4流动相的情况。由于不存在乙腈时使用0.1％cuso4流动相15分钟后未洗脱托酚酮(数据未显示)，评价了百分比变化(恒溶剂5％(然后是有机柱清洁步骤)，21％、40％和3％-11.5％梯度)的乙腈。使用的流速在25℃恒定于0.8ml/分钟。
然后评价各种乙腈含量的流动相，在这些条件下分析的结果总结于表3。在5％乙腈浓度，得到了0.1μg/ml托酚酮标准品的可接受保留值(k＞1.0)、容许脱尾(tf3.02)和可重现的检测。然而，2的标准峰高表明0.1μg/ml接近使用这些条件的检测极限(表3)。此外，此浓度时的峰脱尾远高于2.0μg/ml的(tf1.61)。当乙腈浓度更高(21％和40％)时，托酚酮的保留时间是k＜0.5，因此是不可接受的。
表3.使用含有0.1％cuso4的不同流动相在3根柱上通过rp hplc分析托酚酮标准品(0.1μg/ml和2.0μg/ml)
3.hplc性能以下所有研究使用以上实验2的rp hplc方法和以上实验1的样品制备方法。
(a)线性托酚酮溶液按以上所示以0、1、5、10、20、50、100、500、2000和4000ng/ml托酚酮的浓度用含有抗体的缓冲液配制。通过用2％cuso4沉淀除去缓冲液盐。通过rp hplc分析托酚酮样品。记录峰面积、对托酚酮浓度作图，并构建线性回归图。线性工作范围定义为给予具有可接受精度(≤5％cv)的线性应答(r2≥0.99)的浓度范围。从以5、10、20、50、100、500、2000和4000ng/ml托酚酮的浓度分析的样品构建托酚酮定量的校正曲线。分析每个托酚酮浓度检测的精度。目测和通过回归分析均在1ng/ml和4000ng/ml之间观察到线性应答。相关系数的平方值(r2)表明可接受的线性(r2＝0.9997)。
出于常规定量的目的，构建0ng/ml和2000ng/ml(r2＞0.99)之间浓度的校正曲线。检测5种不同情况中的线性，回归数据总结于表1。
表15次分析的回归数据
(b)特异性检测了标准托酚酮溶液(2000ng/ml)的样品缓冲液相关峰的托酚酮峰分辨率(rs)。记录一式三份分析的5次测定的平均rs、sd和cv％。
如前所述，目测可与托酚酮分辨的样品缓冲液相关峰紧邻托酚酮在其之前洗脱(4.5.2部分，图18和19)。使用usp所定义方法计算5次独立的测定中适合于3种系统的样品进样的托酚酮与该缓冲液相关峰的分辨率。计算平均托酚酮分辨率因子(rs)、sd和cv％，结果总结于表2。
表2适合于托酚酮系统的样品(2000ng/ml)与制剂缓冲液相关峰的分辨率
所有分辨率因子平均值均≥1.5，这表明前面的缓冲液相关峰的分辨可接受并且证实具有可接受的重现性(cv＜3.0％)。从样品制剂或最终的产物样品中观察到无干扰性峰。这证明了检测和定量托酚酮的rp hplc测定的特异性。
(c)检测/定量的极限(lod/loq)进行线性分析的托酚酮样品用于估计托酚酮分析的lod和loq。得到可检测信号的所测试的最低托酚酮浓度指定为lod。具有可接受的重现性(≤5％cv)的检测到的托酚酮的最低浓度定义为loq。发现lod约1ng/ml；loq确定约为5ng/ml，因此这就是本发明测定方法的灵敏度极限。
4.适用铜离子复合物与离子对(ip)试剂在ace c182.1mm柱上评价hplc条件对c18hplc柱上的铜离子托酚酮复合物的分析用3种疏水性不同的不同试剂以反向离子对来测试。这些试剂是极性最大的三氟乙酸(tfa)、极性中等的甲磺酸(msa)和疏水性最强的己磺酸(has)。制备含有离子对试剂、0.1％cuso4和乙腈的流动相。所用hplc参数以及得到的相对峰高和色谱测试的测量值总结于表4。
4.1tfa离子对在流动相中使用可接受的0.1％tfa未充分增加(k＜1.0)托酚酮标准品的保留时间(表4，图10)。在这些条件下进行分析的结论是其不适合于测定托酚酮。
4.2msa离子对在用5％乙腈和0.1％msa的恒溶剂洗脱条件下，含有0.1％msa的流动相得到增加的保留时间(k≥2)。然而，在所测试标准品的两种浓度(0.1μg/ml和2.0μg/ml)均观察到高托酚酮峰脱尾(tf≥3.4)。与5％乙腈/0.1％msa(2的标准峰高)相比，使用含有0.1％msa和10％乙腈的流动相(图11)证实改善了对0.1μg/ml托酚酮标准品的检测(14的标准峰高，表4)，但峰脱尾延长了(tf12.05)。
4.3hsa离子对用0.1％hsa/10％乙腈流动相的等度洗脱显著增加了托酚酮的保留时间(k≥3.4，表4)。此外，观察到0.1μg/ml低托酚酮浓度的峰高增加(27的标准峰高；表4)，所测试的两种托酚酮浓度的峰脱尾可接受且相当(tf≤1.9)。另外，2.0μg/ml(0.9％cv)和0.1μg/ml(3.2％cv)浓度的托酚酮的峰面积重现性可接受(表4)。然而，托酚酮接近流动相峰洗脱，两个峰未显示基线分辨率(图12和13；rs≤1.1)。使用梯度乙腈(10％-42％)或将分析温度增至40℃(rs≤1.0，表4)或将温度降至20℃并将流速降至0.1ml/分钟(rs≤1.3)未能分离托酚酮和流动相的峰。
评价了不同的离子对(has)流动相浓度。0.3％hsa/10％乙腈/0.1％cuso4流动相(流速0.2ml/分钟，25℃)可有效地在两种托酚酮浓度实现托酚酮与流动相峰的基线分离(rs≥3.5，图14和15，表4)。流速进一步降低(0.1ml/分钟)未进一步改善托酚酮的分辨(rs≥3.8)。总之，所建立的用于测定托酚酮标准品的rp hplc方法具有可接受的检测极限、峰对称性和重现性。
表4.使用含有0.1％cuso4和3种不同的离子对试剂的流动相在ace c18柱上通过rp hplc分析托酚酮标准品(0.1μg/ml和2.0μg/ml)
权利要求
1.一种用于测定含有富集的产物蛋白的蛋白质溶液或动物细胞培养物上清液的托酚酮或其衍生物的分析方法，所述方法包括以下步骤a.将蛋白质与托酚酮或其衍生物分离，在该步骤之前或之后进行b.使托酚酮或其衍生物与cu(ii)离子在溶液中形成复合物，c.用疏水固定相和流动相通过反向hplc测定托酚酮或其衍生物，其中所述流动相含有cu(ii)离子和离子对试剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水固定相是烷基-硅烷固定相。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烷基-硅烷固定相是无支链的烷基-硅烷固定相，优选c-18烷基-硅烷。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子对试剂是比三氟乙酸的疏水性更强的离子对羧酸或其盐。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离子对试剂具有等于甲磺酸或己磺酸的介电常数或在二者的介电常数范围内的介电常数，所述离子对试剂优选选自丙磺酸、丁磺酸、戊磺酸、己磺酸和它们的盐。
6.如权利要求11或1所述的方法，其特征在于，所述流动相含有与至少一种其它极性溶剂混合的1-30％的乙腈。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂是水、甲醇、乙醇或它们的混合物，优选流动相含有至少60％的水。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过首先用cuso4沉淀托酚酮或其衍生物并回收该沉淀物，其次通过超滤从回收的沉淀物中除去蛋白质来实现与所述蛋白质的分离。
9.如权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述流动相含有cuso4作为cu(ii)离子源。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述流动相中cuso4的浓度在0.05％(w/v)-0.2％(w/v)范围内。
11.如权利要求1或10所述的方法，其特征在于，所述流动相是水可混溶的。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有蛋白质的上清液或蛋白质溶液富集至1mg/ml或更高的浓度。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述富集的蛋白质是产物蛋白。
全文摘要
本发明设计了一种用于从生物学样品中回收和分析痕量托酚酮的方法。
文档编号g01n31/02gk1871512sq200480030772
公开日2006年11月29日 申请日期2004年8月11日 优先权日2003年8月19日
发明者m·伊贝纳 申请人:英国龙沙生物医药股份有限公司