专利名称：使用半乳凝集素－2基因内单碱基多态性进行的炎症性疾病的判定方法
技术领域：
本发明涉及炎症性疾病的诊断方法，该方法包含检测存在于半乳凝集素-2基因中的基因多态性；还涉及该方法中使用的寡核苷酸、含有该寡核苷酸的炎症性疾病诊断用试剂盒、以及它们的应用。
背景技术：
虽然生活方式发生变化以及有了新的药理学方法，但包括心肌梗塞在内的冠状动脉疾病在很多国家都是主要的死亡原因(breslow，j.l.，nature med.3，600-601，1997；braunwald，e.，n.engl.j.med.，337，1360-1369，1997)。因此，人们强烈希望能够鉴定这些发病的遗传和环境因素。
已知共通的遗传变异与患糖尿病或高血压病等生活方式病的危险性显著相关(risch，n.，等人.，science，273，1516-1517，1996；collins，f.s.，等人.，science，278，1580-1581，1997；lander，e.s.，等人.，science，274，536-539，1996)。鉴定多基因病的感受性基因的方法有利用“连锁”的方法和利用“相关”的方法。连锁分析是检测疾病感受性基因座与遗传标志(主要是微卫星)的座是否连锁，即研究基因座之间的关系，而相关分析是检测特定的遗传标志(主要是单碱基多态性snp)的哪个形态(等位基因)与疾病相关，即研究等位基因间的关系。因此可以说使用共通的变异作为标志的相关分析比对疾病相关基因的局部存在进行分析的连锁分析作用更大。单碱基多态性(snps)是在探求与疾病的易患性或药物反应性有关的基因时有用的多态性标志。snps对基因产物的质或量有直接影响，也可能会增大某种疾病或药物带来严重副作用的危险性。因此，通过探求多种snps，有望进行疾病相关基因的鉴定或建立避免药物副作用的诊断方法。
关于基因突变与心肌梗塞的关系，目前为止有对人前列环素合成酶基因的多态性进行分析、判定心肌梗塞的遗传因素的方法(日本特开2002-136291号公报)等。但是，对于与心肌梗塞相关的基因突变的了解尚不十分清楚。
另一方面，已知目前哺乳类有10种半乳凝集素。其中的半乳凝集素-2与半乳凝集素-1显示43％这样高的同源性。半乳凝集素-2与半乳凝集素-1同样，形成含有两个14kda亚单元的非共价键二聚体，在还原剂非存在下自凝聚，失去活性。另外，半乳凝集素-2与半乳凝集素-1相比，组织分布狭窄。半乳凝集素-1大量存在于以肌肉等间充组织为首的各种细胞系列中，但半乳凝集素-2在正常人组织中多见于以小肠下部为主的上皮细胞中。半乳凝集素-2的详细功能尚未了解(trends in glycoscience and glycotechnology vol.9，no.45，(1997)87-93页)。
发明内容
本发明要解决的课题是鉴定与心肌梗塞等炎症性疾病的发病进程有关的新型单碱基多态性(snp)。本发明另一个要解决的课题是利用鉴定出的snp，提供心肌梗塞等炎症性疾病的诊断方法或炎症性疾病治疗药物的开发方法。
本发明人为解决上述课题进行了深入地研究，结果，通过鉴定半乳凝集素-1和半乳凝集素-2基因产物与心肌梗塞感受性基因产物淋巴毒素-α(lta)的结合、以及鉴定半乳凝集素-2基因内的新型单碱基多态性(snp)与心肌梗塞的发病进程的相关，完成了本发明。
即，本发明提供炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于半乳凝集素-2基因中的至少一种基因多态性。
优选提供以下的炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于半乳凝集素-2基因中的至少一种单碱基多态性。
进一步优选提供以下的炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测在seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性。
优选炎症性疾病是心肌梗塞。
本发明的另一方面提供一种寡核苷酸，该寡核苷酸可以与含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的、至少连续10个碱基序列、或其互补序列杂交，在权利要求1-4中任一项的方法中作为探针使用。
本发明的又一方面提供一种寡核苷酸，该寡核苷酸可以扩增含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的至少连续10个碱基序列、和/或其互补序列，在权利要求1-4中任一项的方法中作为引物使用。
优选引物为正向引物和/或反向引物。
本发明的另一方面提供炎症性疾病诊断用试剂盒，该试剂盒包含一种或以上上述任一项记载的寡核苷酸。优选炎症性疾病为心肌梗塞。
本发明的又一方面提供半乳凝集素-2表达状态的分析方法，该方法包含检测在seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性。
本发明的另一方面提供炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含在候选物质存在下，分析细胞内半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量，选择使该表达量变化的物质的步骤。优选提供以下炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含在候选物质存在下分析细胞内半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量，选择使该表达量增加的物质的步骤。
本发明的又一方面提供炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含在候选物质存在下测定淋巴毒素-α(lta)与半乳凝集素-2基因产物或半乳凝集素-1基因产物的结合，选择抑制该结合的物质的步骤。
本发明的另一方面提供半乳凝集素-2转录活性的测定方法，该方法包含将含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性的半乳凝集素-2基因片段导入细胞，培养该细胞，分析该基因的表达。
本发明的又一方面提供抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的物质的筛选方法，该方法包含将含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性的半乳凝集素-2基因片段导入细胞，在抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的候选物质存在下培养该细胞，分析该基因的表达。
本发明的又一方面提供由上述筛选方法得到的抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的物质。
本发明的方法中，优选将在上述半乳凝集素-2基因片段的下游结合有报道基因的转录单元导入细胞，培养该细胞，通过测定报道活性来分析该基因的表达。进一步优选上述报道基因是荧光素酶基因。
本发明的另一方面提供半乳凝集素-2转录控制因子的筛选方法，该方法包含使含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性的半乳凝集素-2基因片段，与预测存在半乳凝集素-2转录控制因子的试样接触，检测上述片段与转录控制因子的结合。优选检测通过凝胶移位测定进行。
附图简述
图1表示确认lta与半乳凝集素-1和-2体外结合的试验的结果。
图2表示研究半乳凝集素-2基因的内含子1的3279c＞t的snp对转录活性的影响的结果。
图3表示研究半乳凝集素-2与微管的相互作用的结果。a表示与tap标记的半乳凝集素-2相互作用的蛋白质的分离。b表示内源性α-微管蛋白与带有flag标记的半乳凝集素-2或lta免疫共沉淀的实验结果。c表示u937细胞中的内源性α-微管蛋白与内源性半乳凝集素-2或lta共存的实验结果。
图4表示研究冠状动脉粥瘤切除片中的半乳凝集素-2与lta的表达和共存的结果。a用抗人lta染色，b用抗人半乳凝集素-2染色，c用单克隆抗smcα-肌动蛋白染色，d用单克隆抗cd68染色。e用抗lta抗体和抗半乳凝集素-2抗体双重染色。f用抗lta染色。
实施发明的最佳方式本发明中，对于半乳凝集素-1和半乳凝集素-2基因产物与已知作为心肌梗塞等炎症性疾病感受性基因产物的淋巴毒素-α(lta)(ozakik等人.nature genetics 32，650-654，2002)产物的结合进行了鉴定。还鉴定了半乳凝集素-2基因内的新型单碱基多态性(snp)，通过pcr-dna测序法对各约2000名心肌梗塞患者组与对照组进行分类，进行相关分析(x2检验等)，结果发现该新型snp的频率在心肌梗塞患者中在统计学意义上显著少。通过使用荧光素酶测定法的实验，还表明该新型snp具有实际的生物学功能，该半乳凝集素-2基因产物量的变化不仅对于心肌梗塞，还可以引发多种炎症性疾病。
如上所述，本发明中对作为与lta蛋白质结合的新型分子的半乳凝集素-1和半乳凝集素-2蛋白质进行了鉴定。还鉴定出半乳凝集素-2基因内的新型snp具有生物学功能，与心肌梗塞等疾病相关。因此，通过利用本发明鉴定的半乳凝集素-2基因的新型snp，可以开发心肌梗塞等炎症性疾病的新的诊断、预防方法、治疗药物。以下，对本发明的实施方案进一步具体说明。
炎症性疾病的判定方法本发明的方法是通过检测存在于显示与炎症性疾病相关性的半乳凝集素-2基因中的基因多态性、特别是单碱基多态性(snps)，来判定炎症性疾病发病的有无、或炎症性疾病发病的可能性的方法。
本发明中，“检测存在于半乳凝集素-2基因中的至少一种基因多态性(单碱基多态性等)”是指以下两种情况(i)直接检测所述基因多态性(也称为基因侧多态性)，以及(ii)检测存在于上述基因的互补序列一侧的基因多态性(称为互补侧多态性)，并由该检测结果推定基因侧多态性。由于基因侧的碱基与互补序列侧的碱基不一定为完全互补关系，因此更优选直接检测基因侧多态性。
存在于半乳凝集素-2基因中的基因多态性的优选的具体例子有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性。
本说明书中，seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基相当于seq id no.2所示的半乳凝集素-2基因的基因组序列的第3449号碱基。
例如，如后述表1所示，seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基为c时(半乳凝集素-2内含子1 3279c)，可以判定为炎症性疾病发病或者发病的可能性高。
与此相对，seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基为t时(半乳凝集素-2内含子1 3279t)，可以判定为炎症性疾病不发病或者发病的可能性低。
本说明书中，疾病的“判定”是指疾病发病有无的判断、疾病发病的可能性的判断(患危险性的预测)、疾病的遗传因素的阐明等。
疾病的“判定”可以将由上述单碱基多态性的检测法得到的结果、根据需要进行的其它多态性分析(vntr或rflp)和/或其它检查结果结合进行。
本说明书中，“炎症性疾病”只要是可见诱导了已知与炎症性病态相关的细胞粘附因子或细胞因子的疾病即可，没有特别限定，例如有慢性风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎症性肠炎、各种变态反应、细菌性休克、心肌梗塞或脑卒中等动脉硬化性疾病等，特别是心肌梗塞。
(检测对象)基因多态性的检测对象优选基因组dna，但也可根据情况(即多态性位点及其相邻区的序列与基因组相同或完全互补时)使用cdna或mrna。另外，用于采集上述对象的试样可以是任意的生物学试样，例如血液、骨髓液、精液、腹腔液、尿液等体液；肝脏等组织细胞；毛发等体毛；等。基因组dna等可以按照常规方法由这些试样中提取、纯化、制备。
(扩增)检测基因多态性时，首先扩增含有基因多态性的部分。扩增例如可通过pcr法进行，也可以通过其它公知的扩增方法、例如nasba法、lcr法、sda法、lamp法等进行。
引物的选择例如可选择扩增以下序列的引物seq id no.1(或seq id no.3)所示序列中含有上述单碱基多态性位点的连续的至少10个碱基或以上、优选10-100个碱基、更优选10-50个碱基的序列，和/或其互补序列。
引物只要能够发挥作为扩增含有上述单碱基多态性位点的规定碱基数的序列的引物功能即可，该序列中可以含有1个或更多的置换、缺失、附加。
用于扩增的引物可以选择只在试样为等位基因型其中之一时才被扩增，并且正向引物或反向引物的一方与单碱基多态性位点杂交。引物还可以根据需要通过荧光物质或放射性物质等来标记。
(基因多态性的检测)基因多态性的检测可通过与等位基因型其中之一特异性探针杂交来进行。探针可根据需要通过荧光物质或放射性物质等适当的手段来标记。探针只要是含有上述单碱基多态性位点、与受检试样杂交、具有在所采用的检测条件下可以检测这样程度的特异性即可，没有任何限定。探针可以使用例如可与seq id no.1(或seq id no.3)所示序列中含有上述单碱基多态性位点的至少连续10个碱基或以上、优选10-100个碱基、更优选10-50个碱基的序列或它们的互补序列杂交的寡核苷酸。优选选择单碱基多态性位点存在于探针的大致中心部位的寡核苷酸。该寡核苷酸只要可发挥探针功能即可，即，只要是在与目标等位基因型的序列杂交、但不与其它等位基因型的序列杂交的条件下杂交即可，其序列中可以含有1个或更多的置换、缺失、附加。另外，探针还包含象用于rca(滚环扩增)法扩增的单链探针(锁扣探针)那样，通过与基因组dna解链、成为环状而满足上述探针条件的探针。
本发明所使用的杂交条件是足以区分等位基因型的条件。例如试样为等位基因型其中之一时则进行杂交、但为其它等位基因型时则不杂交的条件，例如严紧条件。这里，“严紧条件”是例如分子克隆实验手册第2版(sambrook等人.，1989)中记载的条件等。具体来说，例如有在含有6×ssc(6×ssc的组成0.15m氯化钠、0.015m柠檬酸钠、ph 7.0)、0.5％ sds、5×denhardt和100mg/ml鲱鱼精dna的溶液中与探针一起在65℃保温过夜的条件等。
探针可以将其一端固定于基板，作为dna芯片使用。这种情况下，dna芯片可以只固定与等位基因型其中之一对应的探针，也可以固定与等位基因型两者对应的探针。
基因多态性的检测可通过限制酶切片段长度多态性分析法(relp)进行。该方法中，通过用限制酶消化原料核酸，研究消化物片段的大小，来研究该限制酶是否切断了核酸，由此对试样的多态性进行分析。其中是根据所用基因型的不同，其单碱基多态位点被限制酶是否切断的情况也不同。
基因多态性的检测可通过对扩增产物进行直接的序列确定来进行(直接测序法)。序列的确定例如可通过双脱氧法、maxam-gilbert法等公知的方法进行。
基因多态性的检测还可以采用变性梯度凝胶电泳法(dgge)、单链构象多态性分析法(sscp)、等位基因特异性pcr、通过等位基因特异性寡核苷酸(aso)进行的杂交法、化学切割错配法(ccm)、异源双链法(het)、引物延伸法(pex)、滚环扩增(rca)法等。
炎症性疾病诊断用试剂盒作为上述引物或探针的寡核苷酸可以以含有它们的炎症性疾病诊断用试剂盒的形式提供。试剂盒可以含有上述基因多态性分析法中使用的限制酶、聚合酶、三磷酸核苷、标记、缓冲液等。
半乳凝集素-2的表达状态的分析方法根据本发明，可以通过检测上述单碱基多态性来分析半乳凝集素-2的表达状态。
例如，seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基为c时(半乳凝集素-2内含子1 3279c)，可以判断半乳凝集素-2的表达量低。与此相对，seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基为t时(半乳凝集素-2内含子1 3279t)，可以判断半乳凝集素-2的表达量高。
炎症性疾病治疗药物的筛选方法根据本发明，可通过在候选物质存在下分析细胞内的半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量，选择使该表达量变化的物质，来筛选炎症性疾病的治疗药物。例如，可以在候选物质存在下分析细胞内的半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量，选择使其表达量增加或减少的物质、特别优选选择使其表达量增加的物质。根据本发明，还可以通过在候选物质存在下测定淋巴毒素-α(lta)与半乳凝集素-2基因产物或半乳凝集素-1基因产物的结合，选择抑制该结合的物质，来筛选炎症性疾病的治疗药物。
上述筛选的一个例子可通过如下的步骤进行使细胞与候选物质接触的步骤；分析细胞内的半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量的步骤；以及与候选物质非存在下的条件相比较，选择使上述基因的表达量变化的候选物质作为炎症性疾病治疗药物的步骤。
候选物质可以使用任何物质。候选物质的种类没有特别限定，可以是各种低分子合成化合物，也可以是存在于天然提取物中的化合物，或者也可以是化合物文库、噬菌体表达文库、组合文库。候选物质优选为低分子化合物，优选为低分子化合物的化合物文库。化合物文库的构建是本领域技术人员公知的，也可以使用市售的化合物文库。
半乳凝集素-2转录活性的测定方法根据本发明，还可以通过将含有上述单碱基多态性的半乳凝集素-2基因片段导入细胞，培养该细胞，分析该基因的表达来测定半乳凝集素-2的转录活性。
本发明的优选方案是将在上述半乳凝集素-2基因片段的下游结合有报道基因的转录单元导入细胞，培养该细胞，通过测定报道活性来分析该基因的表达。
例如，单碱基多态性存在于启动子部位时，在含有该单碱基多态性的基因的下游插入报道基因，将该系统导入细胞，培养该细胞，测定报道活性，这样可以测定由于单碱基多态性导致的转录效率的不同。
这里，报道基因可以使用荧光素酶、氯霉素、乙酰转移酶、半乳糖苷酶等的基因。
抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的物质的筛选方法本发明中，通过将上述含有单碱基多态性的半乳凝集素-2基因片段导入细胞，在抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的候选物质存在下培养该细胞，分析该基因的表达，可以筛选抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的物质。
本发明的优选的方案是将在上述半乳凝集素-2基因片段的下游结合有报道基因的转录单元导入细胞，培养该细胞，通过测定报道活性来分析该基因的表达。
例如在具有可见半乳凝集素-2的表达量显著高的单碱基多态性(例如半乳凝集素-2内含子1 3279t)的基因的下游插入报道基因，将该系统导入细胞，在候选物质存在或非存在两种情况下培养该细胞，如果在候选物质存在下进行培养时报道基因的活性下降，则可以选择该候选物质作为半乳凝集素-2转录活性抑制物质。
这里，报道基因可以使用上述例举的基因。
可以使用任何物质作为候选物质。候选物质的种类没有特别限定，可以是各种低分子合成化合物，也可以是存在于天然提取物中的化合物，或者也可以是化合物文库、噬菌体表达文库、组合文库。候选物质优选为低分子化合物，优选为低分子化合物的化合物文库。化合物文库的构建是本领域技术人员公知的，也可以使用市售的化合物文库。
上述的通过筛选法得到的抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的物质也在本发明的范围之内。所述抑制或促进半乳凝集素-2转录活性的物质可用作心肌梗塞治疗药、抗炎症药、免疫抑制剂等各种药物候选物质。
半乳凝集素-2转录控制因子的筛选方法本发明中，还可以通过使含有上述单碱基多态性的基因片段与预测存在半乳凝集素-2转录控制因子的试样接触，检测上述片段与转录控制因子的结合，来筛选半乳凝集素-2转录控制因子。对上述含有单碱基多态性的基因片段与预测存在半乳凝集素-2转录控制因子的物质的结合的检测可以通过凝胶移位法(电泳迁移率分析emsa)、dnase i足迹法等进行，优选凝胶移位法。凝胶移位法中，如果结合有蛋白质(转录控制因子)，则分子大小变大，电泳中的dna迁移率降低，因此将用32p标记的基因片段与转录控制因子混合，进行凝胶电泳。观察放射图谱中的dna位置，则结合有因子的dna移动缓慢，因此可以检测出比常规条带移动慢的条带。
通过以下的实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例(a)方法·材料(1)大肠杆菌双杂交系统(e.coli two hybrid system)使用bacteriomachtm双杂交系统构建试剂盒(stratagene公司制造)进行。用于构建文库的培养人冠状动脉血管平滑肌细胞(hcasmc)购自biowhittaker公司。使用fasttrack 2.0试剂盒(invitrogen公司)，由1×107个细胞制备mrna，使用5μg hcasmc mrna，按照所附说明书构建cdna文库，再按照所附说明书进行双杂交筛选。
(2)重组半乳凝集素-1、-2、-3和lta的制备、通过免疫沉淀确定lta与半乳凝集素的结合半乳凝集素-1、-2、-3通过pet 28载体系统(novagen公司制备)制备全长重组体，按照所附说明书在大肠杆菌中表达、纯化。lta通过pet 29系统(novagen公司制造)制备。抗lta抗体(r&d system公司制造)按照所附说明书，与hitrap nhs-activated hp琼脂糖(amersham公司制造)交联(抗lta抗体琼脂糖)。lta-半乳凝集素的结合实验如下进行向10ml结合缓冲液[10mm tris/hcl(ph 7.5)，150mm nacl]中加入5μg半乳凝集素-1或半乳凝集素-2或半乳凝集素-3，再搅拌1小时。以1600转离心10分钟，撇去上清，将沉淀用清洗缓冲液[10mm tris/hcl(ph 7.5)，150mm nacl，0.1％ np-40]洗涤3次，用50μl的5×sds-试样缓冲液(125mm tris/hcl、4％ sds、20％甘油、10％ β-巯基乙醇、0.04％溴酚蓝，ph6.8)溶解，制成试样。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至硝基纤维素膜，使用抗t7抗体(novagen公司制造)，通过ecl法(amersham公司制造)检测信号。使用cos7细胞(riken cell bank)，通过强制表达系统确认lta与半乳凝集素-2的相互作用(结合)，这个过程是向pflag-cmv-5a载体(コスモバイオ公司制造)导入lta、向pcmv-myc载体(clontech公司)导入半乳凝集素-2作为重组体，使用fugene reagent(罗氏公司制造)转染cos7细胞。回收36小时后的细胞，通过细胞蛋白质提取缓冲液110mm tris/hcl，150mm nacl，0.5％ np-40]提取蛋白质，然后为了抑制非特异性吸附，向该提取液中加入50μl的蛋白a琼脂糖(amersham公司制造)，搅拌1小时。以1600转离心10分钟，将上清作为免疫沉淀的试样。向试样中加入5μg的抗lta抗体，在17℃搅拌1小时，然后加入50μl的蛋白a琼脂糖，在17℃搅拌1小时，以1600转离心10分钟，将沉淀用清洗缓冲液[10mm tris/hcl(ph 7.5)，150mm nacl，0.1％ np-40]洗涤3次，制成试样。sds-page后，转移至硝基纤维素膜，通过抗myc-tag抗体(santa cruz公司制造)、抗flag-tag抗体(sigma公司制造)检测信号。
(3)半乳凝集素-2基因内snps与心肌梗塞的相关分析心肌梗塞患者及对照组、其dna采集方法、dna的测序法、dna分类法、相关性分析的统计学方法按照已有报道实施(ozaki k等人.nature genetics 32，650-654，2002)。半乳凝集素-1和半乳凝集素-2基因区的snps通过使用分别来自16名心肌梗塞和对照的dna，按照pcr直接测序法进行鉴定·发现。
(4)荧光素酶测定法以基因组dna为模板，通过pcr对含有半乳凝集素-2基因的3188至3404的内含子1 3279c或t的snp的区进行扩增，克隆到半乳凝集素-2启动子-pgl3-增强子载体的荧光素酶下游。使用fugenereagent将2μg这些质粒和100mg prl-tk载体(promega公司；为了使转染效率一致的内部标准载体)转染hela细胞(人类科学研究资源库、jcrb9004)和hepg2细胞。24小时后收集细胞，测定荧光素酶活性。
(5)串联亲和纯化串联亲和纯化按照rigaut，g等人.nature biotechnol，17，1030-1032(1999)的方法进行。在pcmv-myc载体(sigma公司制造)中构建编码his标记、tev切断位点和s标记作为tap标记序列的融合盒。该tap载体在巨细胞病毒启动子的控制下，在哺乳动物细胞中表达羧基末端具有tap标记、氨基末端带有myc标记的目标蛋白质。将tap载体瞬时转染hela细胞(人类科学研究资源库、jcrb9004)。通过apro life science的maldi/tof质谱测定装置对目标蛋白质进行分析。
(6)免疫共沉淀试验使用内源性α-微管蛋白与带有flag标记的半乳凝集素-2或lta，如下进行免疫共沉淀。使用fugene，将带有flag或s的标记的lta、半乳凝集素-2、以及lacz(阴性对照)转染hela细胞。免疫共沉淀在溶解缓冲液(20mm tris ph7.5，150mm nacl，0.1％ nonident p-40)中进行。转染24小时后，溶解细胞，使用抗-flag标记m2琼脂糖(sigma公司制造)进行免疫沉淀。使用hrp结合s-蛋白(novagen公司制造)、抗-flag m2过氧化物酶结合物(sigma公司制造)或人α-微管蛋白的小鼠单克隆抗体(molecular probes制备)以及hrp结合抗小鼠igg抗体，使免疫复合物可观察。
(7)共焦显微镜分析使用在大肠杆菌中合成的重组蛋白质，在兔中制备多克隆抗人半乳凝集素-2抗血清。通过蛋白质印迹分析，该抗血清与结构类似的半乳凝集素-1和半乳凝集素-3不显示交叉反应性。将多克隆抗半乳凝集素-2抗血清、山羊抗人lta igg(r&d system制备)或小鼠抗人α-微管蛋白单克隆igg抗体与alexa二次抗体(molecular peobes制备)一同使用。将u937细胞(人类科学研究资源库、jcrb9021)用豆蔻酰佛波醇乙酯(pma)(20ng/ml)刺激30分钟，进行固定。然后在含有3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水中与对应的一次抗体、对应的alexa二次抗体一起温育。
(8)免疫组织化学分析组织试样通过方向性冠状动脉粥瘤切除术，由16名心肌梗塞患者获得。免疫组织化学分析使用山羊抗人lta igg(r&d system制备)和兔多克隆抗人半乳凝集素-2抗体，按照已报道的方法(minami，m等人.arterioscler.thromb.vasc.biol.21，1796-1800(2001)；和shi，s.r.，等人.，hum.mutat.15，7-12(2000))进行。相邻切片的染色使用smc-2肌动蛋白和抗cd68的人细胞型特异性单克隆抗体(dako制备)进行。双重标记的免疫组织化学分析如下进行首先将切片与抗lta抗体一起温育，然后与生物素化猪抗山羊igg、以及抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物一起温育，通过3，3’-二氨基联苯胺四氢化氯(vecter labs)使其可观察。接着，将切片与兔多克隆抗人半乳凝集素-2抗体温育，然后与碱性磷酸酶结合猪抗兔igg温育，通过5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸盐和氮蓝四唑(bcip/nbt)底物系使其可观察。
(b)结果(1)与心肌梗塞感受性基因产物lta结合的蛋白质的鉴定(筛选)为了筛选与lta结合的新型蛋白质，利用大肠杆菌双杂交系统，从来自血管平滑肌细胞的双杂交文库中鉴定半乳凝集素-1作为lta的结合候选蛋白质。
(2)lta与半乳凝集素-1、2体外结合的确认使重组半乳凝集素-1(末端结合有t7标记)和lta分别在大肠杆菌中表达，纯化后，将它们与抗lta抗体交联琼脂糖反应，洗涤后进行sds-page，通过使用抗t7抗体的蛋白质印迹法检测半乳凝集素-1(图1a)。
图1a中，泳道1中使用抗lta抗体琼脂糖进行半乳凝集素-1的免疫沉淀(阴性对照)。泳道-2中将半乳凝集素-1与lta温育，使用抗lta抗体琼脂糖进行复合物的免疫沉淀。泳道3中，使用100ng重组半乳凝集素-1作为阳性对照。星号表示来源于抗lta抗体琼脂糖中的免疫球蛋白(ig)重链和轻链的非特异性条带。
对于与半乳凝集素-1具有高同源性的半乳凝集素-2和-3，由大肠杆菌制备重组蛋白，通过同样的方法确认与lta的结合，表明半乳凝集素-2也与lta结合(图1b)。
图1b中，通过抗t7标记单克隆抗体和辣根过氧化物酶结合抗小鼠igg，通过蛋白质印迹分析，检测与lta共沉淀的半乳凝集素。泳道-1中，温育的半乳凝集素-3和lta，使用抗lta抗体琼脂糖进行免疫沉淀。泳道-2中，温育的半乳凝集素-2和lta，使用抗lta抗体琼脂糖进行复合物的免疫沉淀。泳道-3中，使用抗lta抗体琼脂糖进行半乳凝集素-2的免疫沉淀(阴性对照)。泳道-4和5中，使用100ng半乳凝集素-3(泳道4)或半乳凝集素-2(泳道5)作为阳性对照。星号表示来源于抗lta抗体琼脂糖中的免疫球蛋白(ig)重链和轻链的非特异性条带。
对于半乳凝集素-2，与lta thr26和lta ash26(ozaki k等人.nature genetics 32，650-654，2002)一起导入cos7细胞(猴肾脏细胞株)，通过使用该共强制表达系统的实验系统，在培养细胞水平上确认了其结合(图1c)。
图1c表示使用抗lta抗体的lta与半乳凝集素-2的免疫共沉淀的结果。对cos7细胞转染带myc标记的半乳凝集素-2质粒或带flag标记的lta质粒(thr 26或asn 26)，制备裂解液，使用蛋白a琼脂糖和抗lta抗体用于免疫沉淀。使用myc(半乳凝集素-2)或flag(lta)-抗单克隆抗体-辣根过氧化物酶结合物，通过蛋白质印迹分析，检测与lta共沉淀的半乳凝集素-2。泳道1和2中，将lta26 thr(泳道1)或lta 26 asn(泳道2)进行转染使其沉淀(lta阳性对照)。泳道3中，将半乳凝集素-2转染并沉淀(半乳凝集素-2阳性对照)。泳道4和5中，将半乳凝集素-2和lta 26 thr(泳道4)或lta 26 asn(泳道5)共转染、共沉淀。
(3)半乳凝集素-2基因内单碱基多态性与心肌梗塞的相关已经明确半乳凝集素-1和-2与lta结合，它们的基因产物的功能变化与lta的功能变化相关联，显示与心肌梗塞的感受性相关的可能性，因此新鉴定、发现这些基因内的单碱基多态性(snps)，使用该snps，对患者、对照各约2300例进行了病例-对照关联分析。结果发现，半乳凝集素-2基因内内含子1第3279位c＞t新型snp的次要纯合子(minor homozygote)(tt等位基因)在心肌梗塞患者中显著少(χ2＝25.3，p＝0.0000005；odds ratio＝1.6)(表1)(碱基编号根据突变命名dunnen j.t等、hum.mutation 15，7-12，2000)。由此可认为半乳凝集素-2内含子1 3279的snp是对心肌梗塞发挥保护性作用的因子，半乳凝集素-2的功能变化显示与心肌梗塞相关的可能性。
表1心肌梗塞与半乳糖苷凝集素-2的snp的相关
本发明中新鉴定的半乳凝集素-2基因的内含子1的第3279位c＞t的新型snp周围的碱基序列(seq id no.3seq id no.3中，y表示c或t)如下所示。
5’-cccccccagctctagggacgaccacacccccacccagttctgcctgtctctctctgcgcctttgactctgttgggtggggacaaggctcccgggcctgcaccctcccgcagctctcagcatccctatttgtccaagtgcacccctgaccctggacttccgagtgcttctgccctgcagcagcccccacctctatccttggggtttgagctttgctgtttcagtcaggcagcccccaggagctgcaaggggagtgtgggtgcttctcttagtccaggcccagctcccctatcctggcctgactgttgcagggctcggggtgtgggcacaggctgctggcaggaggcagggagccatctcctgatgcttggtgttaga[c/t]gtgtgtgtgcgcagggcacacgtctgtgagtgtctgtgtggcgggcacacctgtcttctgtttcttgtttgagccccttttggactgtcctcactggataacctcatctcccagagataatggtctttgtcagtgagagactgatttttttttttttttttttttttttgagacggagtct-3’[c/t]表示内含子1的第3279位c＞t的snp。
带下划线的ctgcgcctttgactctgtt和tctttgtcagtgagagactg表示pcr引物，带下划线的cctatcctggcctgactgtt表示测序引物。
(4)半乳凝集素-2基因内含子1 3279的snp对半乳凝集素-2基因转录活性的影响为了测定内含子1 3279的snp对半乳凝集素-2基因转录活性的影响，进行报道基因测定(荧光素酶测定)。将含有半乳凝集素-2基因的内含子1 3188至3404的核苷酸的dna片段沿5’至3’的方向克隆到pgl3-增强子载体的sv40增强子的下游，制备报道载体。将这些报道载体转染hela细胞和hepg2细胞，24小时后，使用双荧光素酶报道测定系统(promega公司制造)测定荧光素酶活性。结果如图2所示(左图表示在hela细胞中的结果，右图表示在hepg2细胞中的结果)。
(5)半乳凝集素-2与微管蛋白的作用为了研究半乳凝集素-2对lta分泌的调控机理，使用串联亲和纯化(tap)系统，探究与半乳凝集素-2相互作用的细胞内分子。结果，鉴定出两个只在表达半乳凝集素-2-tap标记时才可检测到的特异性条带(图3a)。通过maldi/tof质谱分析，显示这两个条带对应微管的重要成分α-和β-微管蛋白。使用表达带有flag标记的半乳凝集素-2的质粒转染的hela细胞，可见内源性的微管蛋白和半乳凝集素-2一起免疫沉淀(图3b)。微管蛋白与lta一起免疫沉淀(图3b)。从双重免疫染色的u937细胞的共焦显微镜分析图像可见半乳凝集素-2和α-微管蛋白作为发达的网状纤维网架而一起局部存在于细胞质上(图3c)。该结果显示半乳凝集素-2与细胞内传输有关的可能性。
(6)冠状动脉粥瘤切除术试样中半乳凝集素-2与lta的表达和共存为了研究半乳凝集素-2与lta是否在心肌梗塞的损伤(即冠状动脉的粥样硬化性损伤)中表达、以及表达时的表达部位，使用抗lta或抗半乳凝集素-2抗体，对冠状动脉粥瘤切除试样进行免疫组织化学染色分析。如图4a和b所示，对lta和半乳凝集素-2的免疫反应性在粥样斑块的内膜细胞中检测出，其中的一部分是纺锤状或限定性地形成空泡的细胞质团。用抗平滑肌细胞(smc)α-肌动蛋白或抗cd68对相邻切片进行免疫染色的结果可见这些细胞的大部分是平滑肌细胞或源于平滑肌细胞的泡沫细胞，也可见一部分巨噬细胞(图4c和d)。通过双重标记免疫组织化学分析，lta和半乳凝集素-2的共表达在大部分多形性平滑肌细胞中可见(图4e)。相对照地，在细胞质仅为纤维斑块的萎缩性平滑肌细胞或正常的内侧平滑肌细胞中，未检测出任何蛋白质的表达(图4f)。这些结果显示lta和半乳凝集素-2在粥样硬化性斑块的内膜平滑肌细胞和巨噬细胞中共表达，但在静止期或正常的内侧平滑肌细胞中不存在。
产业实用性本发明新鉴定出了与心肌梗塞等炎症性疾病的发病进程有关的新型单碱基多态性(snp)。利用本发明中鉴定的snp，可以提供心肌梗塞等炎症性疾病的诊断方法、或炎症性疾病治疗药物的开发方法。
序列表<110>riken et al.
<120>使用半乳糖苷凝集素-2基因内单碱基多态性进行的炎症性疾病的判定方法<130>a41618a<160>3<210>1<211>7967<212>dna<213>智人<400>1gtgaggacac tagccccctg ctgcctgccc cactctgttc atctttgtct ttgcctgggt 60gggggctttt agggaaaacc attgctgtcc ctctctgggc ctcagtttcc ccatctgtgc 120agcaaagaag ttggacagag gtcttttttt aaaaaacagc atcttgggcc aggcgtggtg 180gctcctgctt gtaatcccag cactttggga ggccgaggct ggtggatcat ctgaggttgg 240gagtttgaga ccagcctgac caacatggag aaaccccgtc tctactaaaa aaatacaaaa 300ttggctaggc ctggtggcac atgcctgtaa tcccagctaa tggggaggct gaggcaggag 360aatcacttgg acctgggagg cagaggttat ggtgagccga gattgtgcca ttgcactcca 420gcctgggcaa caagagtgag actccatctc aaaacaacaa caacaataca gcatcttgct 480ctgtcaccag gtggagtgca gtggtggcaa tcataactca ctacggactt gacctccttg 540gcttaaatga tcctcccacc tcagcctctt gagtagctgg gaccccaggc actcactacc 600acactggcta attttgtttg tttcttttct ttctcttttt tttttttttt ttgagatgga 660gtctcgctct gttgcccagg ctggagtgca gtggcccgat ctcagctcac tgcaacctct 720gctgcctggg ttcaagcaat tctctggtct cagcctccca agtagctggg attacaggta 780tgtgtcacca cacctggcta attttttttt ttttgttgag atggagtttc tgttgcccag 840gctggagtgc aatggcacga tctcggctca ccacaacttc cacctcccag gttcaagcga 900ttctcctgcc tcagcctcct gagtagcagg gattacaggc atgggccacc acacccgatt 960
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权利要求
1.炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于半乳凝集素-2中的至少一种基因多态性。
2.炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于半乳凝集素-2中的至少一种单碱基多态性。
3.炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测在seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中炎症性疾病是心肌梗塞。
5.寡核苷酸，该寡核苷酸可以与含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的、至少连续10个碱基序列、或其互补序列杂交，在权利要求1-4中任一项的方法中作为探针使用。
6.寡核苷酸，该寡核苷酸可以扩增含有seq id no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的、至少连续10个碱基的序列、和/或其互补序列，在权利要求1-4中任一项的方法中作为引物使用。
7.权利要求6的寡核苷酸，其中引物为正向引物和/或反向引物。
8.炎症性疾病诊断用试剂盒，该试剂盒包含一种或以上权利要求5-7中任一项的寡核苷酸。
9.权利要求8的试剂盒，其中炎症性疾病为心肌梗塞。
10.乳糖苷凝集素-2表达状态的分析方法，该方法包含检测在seqid no.1所示的半乳凝集素-2基因的内含子1的碱基序列中第3279位碱基的c/t多态性。
11.炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含在候选物质存在下分析细胞内半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量，选择使该表达量变化的物质的步骤。
12.炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含在候选物质存在下分析细胞内半乳凝集素-2基因或半乳凝集素-1基因的表达量，选择使该表达量增加的物质的步骤。
13.炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含在候选物质存在下测定淋巴毒素-αlta与半乳凝集素-2基因产物或半乳凝集素-1基因产物的结合，选择抑制该结合的物质的步骤。
全文摘要
本发明的目的在于鉴定与心肌梗塞等炎症性疾病的发病进程相关的新型的单碱基多态性(snp)。本发明可提供炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于半乳凝集素－2中的至少一种基因多态性。
文档编号g01n33/15gk1871361sq20048003064
公开日2006年11月29日 申请日期2004年8月18日 优先权日2003年8月18日
发明者田中敏博, 大西洋三, 尾崎浩一, 饭田有俊, 堀正二, 中村祐辅 申请人:独立行政法人理化学研究所, 田中敏博, 大西洋三, 尾崎浩一, 饭田有俊, 堀正二