增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法与流程-j9九游会真人

增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法
技术领域
1.本发明涉及一种增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统及方法，涉及生物进化领域。


背景技术：

2.胶原蛋白家族包含28个亚型44个成员，是人体组织结构的主要组成部分之一，是人体中含量最多的蛋白质，约占25-33％。在皮肤层，胶原蛋白占总蛋白质的70％-90％。一个成年人的身体含有大约2-4公斤的胶原蛋白，随着皮肤老化，胶原蛋白会降解和丢失。胶原蛋白是由三条同源或异源肽链组成的三螺旋纤维蛋白，是维持皮肤、组织和器官形态结构的主要成分。胶原蛋白广泛存在于结膜和结缔组织中，在皮肤、关节和骨骼等生物结构中起连接作用。经证实，胶原纤维的厚度和强度随着年龄的增长而被破坏，这与皮肤老化现象有很强的关系，如皱纹、骨稀疏、肌肉无力等。当真皮层的胶原蛋白被氧化断裂时，对表皮的支撑作用消失，导致不均匀的塌陷和皱纹。
3.由于胶原蛋白对维持身体结构很重要，免疫原性较弱，所以胶原蛋白是美容和医疗领域的明星分子。在医疗中，胶原蛋白可与血小板相互作用产生凝血现象，加速伤口愈合。胶原蛋白与伤口紧密结合，渗透到新的组织中，并作为细胞生长的支架。美容方面，胶原蛋白回填疗法是一种临床证明安全的治疗面部皱纹、疤痕或面部皮肤缺陷的方法。在饮食和涂抹中，补充胶原蛋白裂解液将保持皮肤的年轻状态。因此，胶原蛋白产品有着巨大的市场需求。
4.市场上主要有两种胶原蛋白。一种是动物来源的胶原蛋白，主要来自猪、牛和鱼，主要通过酸法和酶法工业化。该方法具有成本低、产量大、技术成熟等优点，但存在纯度控制困难和动物源性疾病感染的风险，异基因胶原蛋白应用于人体时可能引起免疫排斥反应或过敏反应。另一种是重组人源胶原蛋白，主要是利用基因工程方法对菌株进行修饰以产生胶原蛋白，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和转基因作物。该方法具有蛋白纯度高、免疫原性低的优点，在先进市场上具有更大的应用前景。然而，由于胶原蛋白分子量大，结构可重复性强，天然菌株合成胶原蛋白的能力较弱，这使得重组人胶原蛋白的制备成本极高。


技术实现要素：

5.本发明公开了一种增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，包括：
6.(1)m13-t7噬菌体，所述m13-t7噬菌体为giii基因被t7rnap的编码基因所替代的噬菌体m13；
7.(2)辅助质粒，所述辅助质粒上包含t7启动子介导的胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-piii融合蛋白的表达基因；
8.(3)含f质粒的进化菌株，所述辅助质粒转化到进化菌株中。
9.优选的，所述t7rnap的氨基酸序列如seqidno.1所示。
10.优选的，所述t7rnap的编码dna序列如seqidno.2所示。
11.优选的，所述辅助质粒在t7启动子下游插入阻碍t7rnap延伸的序列。
12.优选的，所述阻碍t7rnap延伸的序列如seqidno:5所示。
13.优选的，所述胶原蛋白为人胶原蛋白i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix、xx、xxi、xxii、xxiii、xxiv、xxv、xxvi、xxvii或xxviii；所述弹性蛋白为人弹性蛋白elastin。
14.优选的，所述胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-piii融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:3所示，编码dna序列如seqidno.4所示。
15.本发明还公开了一种增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化方法，其特征在于其步骤包括：
16.(1)构建上述的定向进化系统；
17.(2)将m13-t7噬菌体转化到进化菌株中，作为初级噬菌体，采用已知的诱导技术，例如artp、诱导质粒等方法诱导突变一段时间后，得到滴度提高的m13噬菌体子代，m13噬菌体子代作为下一轮进化的初级噬菌体，重复上述诱导突变的过程，以获得相较于初始的噬菌体m13效价滴度更高的突变体。
18.采用上述方法，本发明获得了一种t7rnap突变体，其序列为在seqidno.1所示序列的基础上进行k345e、p474l两点突变。
19.本发明还公开了一种bl21(de3)菌株，其特征在于其基因组中通过crispr转座的方式整合有上述的t7rnap突变体的编码基因。该菌株可用于改造成表达胶原蛋白或弹力蛋白的工程菌，比如在菌株中转入表达胶原蛋白或弹力蛋白的质粒，或者对菌株的基因组进行改造，使其直接表达胶原蛋白或弹力蛋白。
20.本发明公开的菌株定向进化方法，可以获得具有高转录胶原蛋白和弹力蛋白活性的t7rnap突变体，将t7rnap突变体整合到宿主菌基因组后，可以获得胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的菌株。
附图说明
21.图1为定向进化菌株原理示意图。
22.图2为定向进化菌株流程示意图。
23.图3为定向进化过程中效价的变化。
24.图4为定向进化后测序结果。
25.图5为rt-qpcr检测定向进化前后对胶原蛋白-gyra-piii融合蛋白基因的表达水平。
26.图6为rt-qpcr检测定向进化前后对胶原蛋白和弹性蛋白基因的表达水平。
27.图7为westernblot检测定向进化前后对胶原蛋白的表达水平。
28.图8为westernblot检测定向进化前后对弹性蛋白的表达水平。
具体实施方式
29.以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提
供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1对胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的t7 rnap定向进化。
31.使用噬菌体来辅助t7 rnap的定向进化，使其对胶原蛋白和弹性蛋白的转录能力增强,原理如图1所示。将噬菌体m13基因组上的giii基因替换成t7 rnap，作为待进化的噬菌体。挑选s1030作为进化使用的宿主菌。为了将胶原蛋白的合成与piii蛋白的表达结合起来，使用内含肽系统将胶原蛋白和piii重组成一个融合蛋白。当融合蛋白被翻译出来时，内含肽gyra可切割释放piii，从而实现胶原蛋白和piii表达的共偶联。当突变后的t7 rnap转录的胶原蛋白越多，释放的piii就越多，包装的子代噬菌体就越多，原理见图2。因此，胶原蛋白co3a1-内含肽mxe gyra-piii融合蛋白的dna序列以及阻碍t7 rnap延伸的序列合成于广州艾基生物，构建到pet28a载体上，并转化到s1030菌株中。
32.构建待进化的噬菌体及进化使用的宿主菌的步骤如下：
33.t7 rnap dna片段(引物a(tggagcctttttttttggagattttcaacatgaacac-gattaacatcgctaagaacg，seq id no.6)和引物b(ggagggaaggtaaatattgacggaaattacgcgaacgcgaag-tccgactctaagatgtc，seq id no.7))使用hieffgold high fidelity dna polymerase(yeasen biotechnology shanghaico.ltd,cat.no.10148es60)进行扩增。以m13噬菌体为模板，以引物a(tttttgaaaatctccctccctcaatcgg，seq id no.8)和引物b(catgttgaaaatctccaaaaaaaggctccaaaagg，seq id no.9)为引物，利用dna聚合酶(dna polymerase)扩增不含giii的m13基因组骨架。利用hieffplus multi one step clone mix(翌圣生物，10912es10)克隆试剂盒，克隆t7 rnap到不含giii的m13基因组骨架中。克隆产物转化到含pjc175e质粒的s1030菌株。将转化后的s1030-pjc175e在37℃培养过夜，用于m13噬菌体复制、包装和释放。瞬时离心后稀释含噬菌体上清液，感染新鲜菌株s1030-pjc175e，采用双层琼脂糖板法测定滴度。从新鲜菌株s1030-pjc175e中选取单克隆噬菌体进行扩增。采用细菌pcr鉴定片段插入的正确性，pcr产物通过sanger测序进一步验证。
34.每一轮进化分为三个步骤。首先，将t7 rnap的m13初级噬菌体添加到100μl含有胶原蛋白co3a1-内含肽mxe gyra-piii融合蛋白质粒的新鲜s1030菌株中，最终浓度为10,000-100,000cfu/ml；37℃孵育20min后，瞬时离心除去培养基上清。然后用10μl新鲜lb培养基加100mg/l氨苄西林再悬浮细菌沉淀。我们采用30s artp处理4次，使含噬菌体菌株发生突变，然后加入90μl新鲜lb培养基，加入100mg/l氨苄青霉素稀释至100μl。突变菌株在37℃、转速为100rpm的条件下培养。直至噬菌体滴度达到1,000,000cfu/ml。如果噬菌体滴度仍低于1,000,000cfu/ml，则使用s1030-pjc175e扩增m13噬菌体。最后，收集10000rpm离心1min的培养基上清，得到m13噬菌体子代。m13子代噬菌体作为下一轮进化的初级噬菌体。噬菌体效价检测结果见图3。我们将进化后的噬菌体进行测序，获得突变位点(见图4)，突变后的t7 rnap为在seq id no.1的基础上具有k345e、p474l两点突变。我们利用crispr转座的方法(doi.org/10.1021/acssynbio.0c00073)，将进化后的t7 rnap序列整合到大肠杆菌bl21的基因组is1位点，获得进化后的大肠杆菌bl21菌株。
35.实施例2
36.将含有胶原蛋白co3a1-内含肽mxe gyra-piii融合蛋白的pet28a质粒转入实施例1获得的bl21菌株。在50mg/l卡那霉素平板上挑取单克隆后，在含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中充分培养后，使用细菌rna提取试剂盒(翌圣生物，cat#19301es50)提取总rna，并用翌圣生物的v one-step rt-gdna digestion supermix for qpcr和qpcr sybr green master mix(no rox)对giii基因的转录水平进行定量，定量引物使用cggttgaatgtcgcccttttgtctttgg(seq id no.10)和ggtgctcgagttaagactccttattacgcag(seq id no.11)。操作按照说明书指示进行。定量结果见图5。
37.实施例3
38.人胶原蛋白iii、人弹性蛋白dna经密码子优化后，合成于广州艾基生物，并分别构建于pet-28a载体上。将构建好的载体转入实施例1获得的bl21菌株。在50mg/l卡那霉素平板上挑取单克隆后，在含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中培养至od600值达到0.6时，加入1mm iptg诱导表达过夜，使用细菌rna提取试剂盒提取总rna，并用翌圣生物的v one-step rt-gdna digestion supermix for qpcr和qpcr sybr green master mix(no rox)对giii基因的转录水平进行定量，定量引物使用aagcttgcggccgcactc和gctcagcggtggcagcag。操作按照说明书指示进行。定量结果见图6。
39.此外，将获得的菌液离心，加入1x sds-page loading buffer煮沸10min。12000rpm离心2min取上清，使用hepes-tris 12％高分辨率预制胶(hepes-tris)按照说明书进行电泳。使用湿转仪将page胶上的蛋白转移至pvdf膜上，250ma转移3h。加入5％脱脂奶粉封闭过夜，使用abclonal的hrp-conjugated mouse anti his-tag mab按照1：5000稀释后孵育pvdf膜2h。pbst充分清洗膜4次，使用翌圣生物的ecl化学发光超敏显色试剂盒对pvdf膜进行显影检测。结果见图7和图8，进化后的菌株具有更强的合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力。