1.本发明涉及一种包含黑酵母来源的外泌体作为有效成分的用于改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、改善肤色、改善皮肤亮度、再生皮肤、保湿皮肤和/或美白的化妆料组合物。
背景技术：
2.据悉，如果皮肤老化，则皮肤弹性减少，皮肤皱纹增加，而皮肤弹性减少和皮肤皱纹形成是由于胶原蛋白的合成减少并且分解胶原蛋白的酶mmp(基质金属蛋白酶，matrix metalloproteinase)的表达促进而出现的。
3.已知对改善皮肤皱纹有效的物质有腺苷、视黄酸(retinoic acid)等，但腺苷在临床上的功效不显著，视黄酸不能用于育龄女性，并且具有红斑等副作用。因此，使用植物或天然物的有效成分的皮肤抗老化用功能性化妆品最近备受关注。但是，包含植物提取物作为有效成分的功能性化妆品在涂布于皮肤后溶液蒸发的过程中可能会产生异物感，并存在效果持续时间短的问题。
4.决定人肤色的黑色素(melanin)是由黑色素细胞(melanocyte)生成的。具体地，黑色素是以生物体内存在的氨基酸即酪氨酸(tyrosine)为基质，通过存在于黑色素细胞的酪氨酸酶(tyrosinase)等酶引起的聚合氧化反应形成的黑褐色色素。这样形成的黑色素通过黑色素细胞的树枝状突起移动到称为角质形成细胞(keratinocyte)的表皮细胞。移动到角质形成细胞的黑色素可以在角质形成细胞从表皮上脱落时一起从皮肤上脱落而去除。但是，由于生物体内没有分解黑色素的酶，因此一旦形成的黑色素在生物体内无法分解。因此，为了使皮肤变亮，可以说关键是抑制黑色素的生成。
5.作为化妆品的美白剂的研究，随着最近在情感上偏爱白皙皮肤的东方圈生活水平的提高以及皮肤黑化被认为是紫外线引起的皮肤老化，其必要性正在逐渐增加。因此，抗坏血酸(ascorbic acid)、对苯二酚(hydroquinone)、谷胱甘肽(glutathione)、熊果苷(arbutin)等表现出抑制酪氨酸酶活性的物质一直配入化妆料或医药品中并使用，但其中大部分存在效果不充分或剂型上不稳定的一面，因此利用率较低。特别是，诸如对苯二酚等化合物表现出强烈的脱色作用，其本身具有皮肤致敏性，因此可诱发皮肤过敏等，并且改变正常皮肤的功能而产生诱发白斑症等的副作用，因此在对皮肤的安全性方面其使用受到限制。
6.皮肤是人体的第一道保护屏障，保存体内水分，防止过度散发，并保护人体免受来自外部的多种刺激(化学物质、大气污染物质、干燥环境、紫外线等)。皮肤大致由表皮、真皮和皮下脂肪组成，表皮又分为角质层、颗粒层、有棘层、基底层。当由角质形成细胞和角质细胞间脂质膜组成的表皮的角质层正常形成时，可以维持皮肤的保护功能。通过锁住角质形成细胞的水分的功能、以及防止角质细胞间脂质膜的水分损失的功能，人类可以将皮肤的水分保有量维持在约30％。
7.在人的角质形成细胞中，会表达将水分和甘油输送到细胞内的跨膜蛋白即水通道
蛋白3(aquaporin 3,aqp3)。aqp3是一种调节细胞间的水分和甘油移动的蛋白质，在aqp3基因表达受到抑制的老鼠模型中，发现皮肤屏障受损，皮肤弹性和水分含有能力下降。
8.另外，透明质酸是皮肤的天然保湿因子，是在表皮层中锁住水分的重要基质。透明质酸合酶即透明质酸合酶2(hyaluronan synthase 2,has2)和透明质酸合酶3(has3)在皮肤表皮中表达，也被用作评价皮肤保湿能力的指标。
9.最近，由于环境或生活方式的改变、社会生活中产生的各种压力和环境污染、化妆习惯带来的频繁洁面等原因，角质层的水分减少，从而皮肤变得干燥，表面变得粗糙，并且皮肤失去光泽，从而产生看起来暗沉等现象，因此与皮肤保湿相关的问题的重要性越来越大。
10.因此，需要开发在改善皮肤皱纹、改善皮肤弹性、改善皮肤纹理、改善肤色、改善皮肤亮度、再生皮肤、美白皮肤和/或保湿皮肤等皮肤状态改善效果优异的同时无副作用且使用简便的新美容材料。
11.另一方面，最近有研究报告称，细胞分泌物(分泌组，secretome)中包含有调节细胞行为(behavior)的多种生物活性因子，特别是细胞分泌物中包含有具有细胞间信号传递功能的“外泌体(exosome)”，因此对其成分和功能的研究正在积极进行。
12.细胞向细胞外环境释放多种膜(membrane)类型的囊泡，通常将这些释放的囊泡称为细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)。细胞外囊泡也称为源自细胞膜的囊泡、胞外体(ectosomes)、脱落囊泡(shedding vesicles)、微粒(microparticles)、外泌体等，根据情况也会与外泌体区分使用。
13.外泌体是由与细胞膜结构相同的双层磷脂膜组成的数十至数百纳米尺寸的囊泡，内部包含有称为外泌体货物(cargo)的蛋白质、核酸(mrna、mirna等)。据悉，外泌体货物包含范围广泛的信号传导因子(signaling factors)，这些信号传导因子对细胞类型具有特异性，并且根据分泌细胞的环境而受到不同调节。据悉，外泌体是由细胞分泌的细胞间信号传递介质，通过其传递的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、移动、分化、去分化、凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。外泌体根据来源细胞的性质和状态包含有特异性的遗传物质和生物活性因子。对于源自增殖的干细胞的外泌体，调节细胞的移动、增殖和分化等细胞行为，并反映与组织再生相关的干细胞的特性(nature review immunology 2002(2)569-579)。
14.即，称为细胞化身的外泌体与细胞类似，包含有生长因子等生物活性因子，起到在细胞和细胞之间运输生物活性因子的传递体作用，即起到细胞和细胞之间的通信作用。据悉，外泌体不仅从干细胞、免疫细胞、成纤维细胞和癌细胞等动物细胞中释放，还从植物、细菌(bacteria)、真菌(fungi)、藻类(algae)等多种生物的细胞中释放。
15.黑酵母(aureobasidium pullulans)是自然界中广泛存在的不完全菌类，是生成黑色素色素，并且根据培养条件除菌体外还大量生产β-1,3-1,6-葡聚糖的菌类。黑酵母在30℃下生长最佳，在10℃至35℃下生长。黑酵母生产的高分子多糖类即普鲁兰多糖(pullulan)在食品工业中用于赋予果冻等物性。另外，正在开发将液态食品放入普鲁兰多糖(pullulan)膜中的新食品。黑酵母来源的β-葡聚糖是在培养基中生物合成的菌体外多糖，无需纯化，具有水溶性且易于加工。
16.因此，黑酵母广泛应用于食品、化妆品领域等。然而，对源自黑酵母的外泌体的分
离
·
纯化和特性分析的研究还处于未尽状态。因此，需要对源自黑酵母的外泌体进行更详细的特性分析和功能研究。
17.虽然已经介绍了使用微生物的发酵物或培养液的化妆品，但一部分发酵物或培养液可能会在具有敏感皮肤的人中引起皮肤问题、皮肤发红、或皮炎等副作用。
18.另一方面，应当理解，上述作为背景技术描述的事项仅用于增强对本发明背景的理解，并不是作为可用作本发明的现有技术的认可而引用。
技术实现要素：
19.技术课题
20.在上述情况下，本发明人为了开发与黑酵母发酵物或培养液相比效果有所改善的化妆料组合物而进行了研究，确认了源自黑酵母的外泌体具有优异的改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、改善肤色、改善皮肤亮度、再生皮肤、保湿皮肤和美白皮肤的功效，从而完成了本发明。
21.因此，本发明的目的在于提供一种皮肤状态改善用化妆料组合物，其包含黑酵母来源的外泌体作为有效成分。
22.技术方案
23.为了实现上述目的，本发明提供了一种皮肤状态改善用化妆料组合物，其包含黑酵母(aureobasidium pullulans)来源的外泌体作为有效成分。
24.本说明书中使用的术语，“黑酵母(aureobasidium pullulans)”是属于短梗霉属(aureobasidium)属的菌类，是没有菌丝且不具有运动性和光合性能的单细胞生物。黑酵母是自然界中广泛存在的不完全菌类，生成黑色素色素，并且根据培养条件除菌体外还大量生产β-1,3-1,6-葡聚糖。
25.本说明书中使用的术语，“外泌体(exosomes)”是指由黑酵母分泌或释放到细胞外空间的具有膜结构的纳米尺寸的小囊，也被定义为外泌体样囊泡(vesicle)或外泌体样颗粒。
26.本说明书中使用的术语，“黑酵母来源的外泌体”的术语是指包括所有例如从黑酵母培养液或黑酵母发酵物、或与其等同的黑酵母的生物学溶液中分离出来的或者由黑酵母本身分泌和/或释放的外泌体。为了生产黑酵母来源的外泌体，可以使用本领域中使用的或将来可能使用的多种黑酵母菌株，并且实施例中使用的黑酵母菌株应被理解为本发明中可以使用的黑酵母菌株的实例，并且清楚地表明本发明不限于此。
27.本说明书中使用的术语，“改善皮肤状态”是指减轻与皮肤状态恶化相关的症状的程度，并且皮肤状态可以是与皮肤弹性、皮肤皱纹、皮肤纹理、肤色、皮肤亮度、皮肤再生、皮肤美白和皮肤保湿相关的参数。
28.具体地，“改善皮肤弹性”是指通过促进胶原蛋白合成等增加皮肤脂肪组织的体积来维持或增加皮肤的紧致感以及收缩松弛的皮肤组织的效果。
29.另外，“皮肤皱纹”是指因皮肤衰老而产生的细纹，可通过由基因引起的原因、皮肤真皮中存在的胶原蛋白和弹性蛋白的减少、外部环境等而诱发。因此，本说明书中使用的术语“改善皮肤皱纹”是指抑制或阻碍皮肤上产生皱纹，或者缓解已经产生的皱纹。
30.另一方面，本说明书中使用的术语“肤色”是指皮肤的颜色强或弱的程度的状态，“改善肤色”是指使不均匀的肤色变得均匀。“美白皮肤”和“改善皮肤亮度”包括增加因黑色素等色素过多而导致亮度降低的皮肤的亮度，或者将皮肤的亮度维持在一定水平。
31.另外，“再生皮肤”是指因皮肤外部和内部原因而受损的皮肤组织得到恢复。作为上述外部原因，可以列举紫外线、外部污染物质、创伤、外伤等，并且作为上述内部原因，可以列举疾病、压力等。“保湿皮肤”是指阻碍或抑制皮肤的水分减少或者增加皮肤的水分含有量，使皮肤表面光滑并赋予光泽。
32.从下述实施例中可以确认，上述黑酵母来源的外泌体传递至皮肤成纤维细胞(图2)，增加胶原蛋白合成(图3)。另外，在黑素瘤(melanoma)细胞中抑制黑色素生成(图5)，促进透明质酸合酶或水通道蛋白(aquaporin)合成。
33.因此，包含黑酵母来源的外泌体的化妆料组合物可以表现出选自由改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、改善肤色、改善皮肤亮度、再生皮肤、美白皮肤和保湿皮肤的效果组成的组中的一种以上的效果。
34.另一方面，本发明的皮肤状态改善用化妆料组合物可以制成选自由露剂、液剂、霜剂、沉积面膜剂、凝胶剂、气溶胶剂和粉末剂组成的组中的至少一种的剂型。
35.上述露剂是指将化妆料组合物的有效成分和乳化剂等混合并使油性成分和水性成分均质后制成粘液状的剂型，霜剂是指将化妆料组合物的有效成分和乳化剂等混合并使油性成分和水性成分均质后制成半固体状的剂型。另外，液剂是将化妆料组合物的有效成分和其他成分溶解在溶剂等中而制成液状的剂型，凝胶剂是指由渗透液体的分子量较大的有机分子组成的半固体状。
36.沉积面膜剂是将露剂、霜剂、液剂、凝胶剂等沉积在无纺布等支撑体而制成的剂型，可以制成贴剂(patch)、面贴式面膜(mask pack)、面膜片材(mask sheet)等。气溶胶剂是指制成使得利用填充在相同容器或不同容器中的喷射剂(液化气体、压缩气体等)的压力，将原液以雾状、泡沫状等喷出。另外，粉末剂是指均匀地制成粉末状或微粒状，并且可以使用赋形剂等。
37.例如，本发明的皮肤状态改善用化妆料组合物可以制成露剂或霜剂，或者涂布或沉积在贴剂、面贴式面膜或面膜片材的至少一个表面上。
38.另一方面，本发明的皮肤状态改善用化妆料组合物用于改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、改善肤色或皮肤亮度、再生皮肤、保湿皮肤、和/或美白皮肤等的目的，并且还可以以本领域通常制备的任何形式制备。例如，可以制备成贴剂、面贴式面膜、面膜片材、柔肤水、营养化妆水、收敛化妆水、营养霜、按摩霜、眼霜、清洁霜、精华液、眼部精华液、清洁露、清洁泡沫、清洁水、防晒霜、口红、皂、洗发水、含表面活性剂的清洁剂、入浴剂、身体露、身体霜、身体油、身体精华液、身体清洁剂、染发剂、毛发滋补剂(hair tonic)等，但不限于此。
39.另一方面，本发明的一个具体例的皮肤状态改善用化妆料组合物可以在不损害本发明效果的范围内根据需要额外地包含化妆料组合物中常用的成分，例如保湿剂、氧化防止剂、油性成分、紫外线吸收剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。
40.另外，本发明的一个具体例的皮肤状态改善用化妆料组合物除了黑酵母来源的外泌体之外，还可以在不损害其作用(改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、再生皮
肤、保湿皮肤、改善肤色或皮肤亮度、美白皮肤、美容皮肤等)的前提下与以往使用的皮肤改善剂、抗氧化剂和/或保湿剂混合使用。例如，本发明的黑酵母来源的外泌体可以担载或混合在水凝胶、透明质酸、透明质酸盐(例如透明质酸钠等)、或透明质酸凝胶中的至少一种中。在本发明的一个具体例的化妆料组合物中，上述水凝胶的种类没有限制，但优选地可以是将凝胶化高分子分散在多元醇中而获得的水凝胶。上述凝胶化高分子可以是选自由普朗尼克(pluronic)、精制琼脂、琼脂糖(agarose)、结冷胶(gellan gum)、海藻酸、角叉菜胶(carrageenan)、肉桂胶(cassia gum)、黄原胶、半乳甘露聚糖(galactomannan)、葡甘露聚糖(glucomannan)、果胶、纤维素、瓜尔胶和刺槐豆胶(locust bean gum)组成的组中的至少一种，上述多元醇可以是选自由乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油组成的组中的至少一种。
41.另外，本发明的皮肤状态改善用化妆料组合物可以附外地包含一种以上的普通皮肤化妆料中配入的化妆学上可接受的载体，作为常规成分，可以适当地配入例如油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增稠剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等，但不限于此。
42.当本发明的剂型为粉末剂或气溶胶剂时，作为载体成分，可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉或其混合物，特别是，当为气溶胶剂时，可以附加地包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
43.当本发明的剂型为霜剂或凝胶剂时，作为载体成分，可以利用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶(tragacanth)、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
44.当本发明的剂型为液剂中的溶液或乳浊液时，作为载体成分，可以利用溶剂、溶剂化剂或乳浊化剂，例如可以利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯(ethyl acetate)、苯甲醇、苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯。
45.当本发明的剂型为液剂中的悬浮液时，作为载体成分，可以利用诸如水、乙醇或丙二醇等液体稀释剂、诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯等悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂糖(agarose)或黄蓍胶等。
46.本发明的另一方面提供了一种除治疗用外的改善哺乳动物皮肤的美容方法，包括将上述皮肤状态改善用化妆料组合物应用于哺乳动物皮肤的步骤。
47.上述哺乳动物可以是人、狗、猫、啮齿类、马、牛、猴、或猪，但不限于此。
48.在本发明的美容方法中，改善皮肤的状态是指皮肤组织的外观和感觉的视觉和/或触觉上可感知的积极变化。例如，改善皮肤状态可以是改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、改善肤色、改善皮肤亮度、再生皮肤、保湿皮肤和/或美白皮肤。
49.在本发明中，将上述皮肤状态改善用化妆料组合物应用于哺乳动物皮肤的步骤可以是(a)将上述皮肤状态改善用化妆料组合物直接涂布于哺乳动物皮肤的步骤、或(b)将涂布或沉积有上述皮肤状态改善用化妆料组合物的贴剂、面贴式面膜或面膜片材接触或附着于哺乳动物皮肤的步骤、或依次进行上述(a)和(b)的步骤。在上述(a)步骤中可以使用露剂或霜剂剂型的皮肤状态改善用化妆料组合物。
50.另外，本发明的美容方法可以进一步包括(c)在上述(b)步骤之后，将上述贴剂、面贴式面膜或面膜片材从哺乳动物的皮肤上去除，并将上述皮肤状态改善用化妆料组合物涂
布于哺乳动物皮肤的步骤。在上述(c)步骤中可以使用露剂或霜剂剂型的皮肤状态改善用化妆料组合物。
51.另一方面，本发明中记载的所有成分优选地可以在不超过化妆品安全标准等相关规定以及中国“化妆品安全
·
技术规范”中规定的最大使用值的范围内包含在本发明的组合物中。
52.发明效果
53.本发明的化妆料组合物具有优异的改善皮肤弹性、改善皮肤皱纹、改善皮肤纹理、改善肤色或皮肤亮度、再生皮肤、保湿皮肤和/或美白皮肤的效果，因此可以有效地用于皮肤状态改善用途。
附图说明
54.图1是显示对本发明的黑酵母来源的外泌体进行nta(纳米颗粒跟踪分析，nanoparticle tracking analysis)而获得的颗粒尺寸分布和颗粒数的图。
55.图2是显示荧光染色的黑酵母来源的外泌体传递至人体皮肤成纤维细胞的细胞荧光显微镜图像(绿色：传递至细胞中的外泌体，蓝色：细胞核)。
56.图3是显示用黑酵母来源的外泌体以低浓度和高浓度处理人体皮肤成纤维细胞后相对胶原蛋白量的图。
57.图4是显示荧光染色的黑酵母来源的外泌体传递至黑素瘤细胞的细胞荧光显微镜图像(绿色：传递至细胞中的外泌体，蓝色：细胞核)。
58.图5是显示用黑酵母来源的外泌体以低浓度和高浓度处理黑素瘤细胞后黑色素生成量减少的图。
具体实施方式
59.在下文中，在下述实施例中更具体地描述本发明。然而，下述实施例仅用于例示本发明的内容，而非限制或限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的普通技术人员可以从本发明的详细描述和实施例中容易地推测出的内容被解释为属于本发明的保护范围。本发明中引用的参考文献作为参考整合到本发明中。
60.在整个说明书中，当提及某个部分“包含”某个构成要素时，这意味着除非具有特别相反的记载，否则可以进一步包含其他构成要素，而不是排除其他构成要素。
61.实施例1：制备黑酵母来源的外泌体
62.黑酵母菌株aureobasidium pullulans ofy11-1菌株(从kctc获得；保藏编号14158bp)振荡培养，然后对培养基进行离心，以进行颗粒化并去除黑酵母细胞。
63.利用切向流过滤装置(tangential flow filtration；tff)从去除黑酵母细胞的培养液中分离出黑酵母来源的外泌体。
64.分离出的黑酵母来源的外泌体的尺寸和浓度通过利用ns300(购自malvern panalytical)的纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis；nta)确认(图1)。
65.实施例2：确认黑酵母来源的外泌体的皮肤成纤维细胞传递能力
66.如下确认黑酵母来源的外泌体是否传递至人体皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblast；hdf，购自atcc)内。
67.将实施例1中制备的黑酵母来源的外泌体的膜与pkh67(sigma-aldrich)荧光染料反应以进行荧光染色。反应后，将反应液用mw3000(thermo fisher)柱分级，去除外泌体膜上未染色的游离pkh67(free pkh67)荧光染料。作为阴性对照群，使用将pkh67荧光染料与缓冲溶液反应后用mw3000分级的那些。将由pkh67染色的外泌体与预先培养制备的人体皮肤成纤维细胞一起培养后，用荧光显微镜观察外泌体是否随时间在细胞内传递。在细胞核染色中使用赫斯特(hoechst)荧光染料(thermo fisher)，在细胞膜染色中使用cellmask orange荧光染料(thermo fisher)。
68.用荧光显微镜确认黑酵母来源的外泌体是否在细胞内传递的结果，确认绿色荧光在细胞内部随着时间的经过而累积，从而可以看出黑酵母来源的外泌体传递至细胞内(图2)。
69.实施例3：确认黑酵母来源的外泌体的促进胶原蛋白生成的效果
70.将分散在包含胎牛血清(fetal bovine serum；fbs)的dmem培养基中的人体皮肤成纤维细胞以每孔5x104的浓度分株到24孔板中并培养24小时。
71.然后，将实施例1中制备的黑酵母培养液或黑酵母来源的外泌体在无血清培养基中稀释，并且用其处理人体皮肤成纤维细胞，并将人体皮肤成纤维细胞培养24小时。为了确认利用人体皮肤成纤维细胞生成胶原蛋白的功效，将实验群分类如下：
72.(1)阴性对照群(图3中表示为“对照(control)”)：仅处理无血清培养基的实验群；
73.(2)黑酵母培养液处理群(图3中表示为“cm”)：将实施例1中制备的黑酵母培养液稀释在无血清培养基中并进行处理的实验群(颗粒数基准处理浓度：3.0x109个颗粒/ml)；
74.(3)黑酵母来源的外泌体低浓度处理群(图3中表示为“外泌体低(exosome low)”)：将实施例1中制备的黑酵母来源的外泌体以低浓度稀释在无血清培养基中并进行处理的实验群(颗粒数基准处理浓度：3.0x109个颗粒/ml)；
75.(4)黑酵母来源的外泌体高浓度处理群(图3中表示为“外泌体高(exosome high)”)：将实施例1中制备的黑酵母来源的外泌体以高浓度稀释在无血清培养基中并进行处理的实验群(颗粒数基准处理浓度：3.0x10
10
个颗粒/ml)。
76.将人体皮肤成纤维细胞培养24小时后，回收培养液并进行离心，以制备离心的培养液。用i型前胶原c肽(procollagen type i c-peptide,pip)的eia试剂盒(购自takara)测定由人体皮肤成纤维细胞合成并在培养液中累积的胶原蛋白量。通过将测定的胶原蛋白量除以用mtt检测试剂盒(购自sigma-aldrich)测定的总细胞数来进行归一化，从而确定相对胶原蛋白量。
77.其结果，与阴性对照群相比，黑酵母来源的外泌体显著增加了人体皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白合成，特别是，可以确认随着处理浓度的增加，胶原蛋白合成进一步增加(图3)。即，可以确认本发明的黑酵母来源的外泌体浓度依赖性地增加人体皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白合成。
78.另外，可以看出在相同浓度(颗粒数基准处理浓度：3.0x109个颗粒/ml)下，与黑酵母培养液处理群相比，黑酵母来源的外泌体低浓度处理群中人体皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白生成量更多(图3)。
79.因此，本发明的含有黑酵母来源的外泌体作为有效成分的化妆料组合物具有增加胶原蛋白合成的活性，并且黑酵母来源的外泌体可以有效地用作用于改善皮肤皱纹、改善
皮肤弹性和/或再生皮肤的功能性化妆料组合物的有效成分。
80.实施例4：确认黑酵母来源的外泌体的小鼠黑素瘤细胞传递能力
81.如下确认黑酵母来源的外泌体是否传递至小鼠黑素瘤(b16f10；购自atcc)内。
82.将实施例1中制备的黑酵母来源的外泌体的膜与pkh67荧光染料反应以进行荧光染色。反应后，将反应液用mw3000柱分级，去除外泌体膜上未染色的游离pkh67荧光染料。作为阴性对照群，使用将pkh67荧光染料与缓冲溶液反应后用mw3000分级的那些。将由pkh67染色的外泌体与预先培养制备的b16f10细胞一起培养后，用荧光显微镜观察外泌体是否随时间在细胞内传递。在细胞核染色中使用赫斯特荧光染料，在细胞膜染色中使用cellmask orange荧光染料。
83.用荧光显微镜确认黑酵母来源的外泌体是否在细胞内传递的结果，确认绿色荧光在细胞内部随着时间的经过而累积，从而可以看出黑酵母来源的外泌体传递至黑素瘤细胞内(图4)。
84.实施例5：抑制黑色素生成的效果
85.黑酵母来源的外泌体的美白效果通过对黑素瘤细胞的黑色素生成抑制程度来确认。上述黑素瘤细胞是源自小鼠黑色素瘤的细胞，分泌称为黑色素的黑色色素。将黑素瘤细胞以每孔8x103的浓度分株到48孔板中，然后在包含10％胎牛血清的不含酚红的dmem培养基中培养24小时。
86.然后，将实施例1中制备的黑酵母来源的外泌体在混合有黑色素合成刺激剂α-msh(α-黑素细胞刺激素，α-melanocyte stimulating hormone)的培养基中稀释，然后用其处理黑素瘤细胞，并将黑素瘤细胞培养48小时。将实验群分类如下：
87.(1)阴性对照群(图5中表示为“阴性对照(negative control)”)：用混合有黑色素合成刺激剂α-msh的培养基处理的实验群；
88.(2)阳性对照群(图5中表示为“阳性对照(positive control)”)：用混合黑色素合成刺激剂α-msh和熊果苷(arbutin)(最终浓度：1mm)的培养基处理的实验群；
89.(3)黑酵母来源的外泌体低浓度处理群(图5中表示为“外泌体低(exosome low)”)：用混合黑色素合成刺激剂α-msh和低浓度的黑酵母来源的外泌体的培养基处理的实验群(颗粒数基准处理浓度：3.0x109个颗粒/ml)；
90.(4)黑酵母来源的外泌体高浓度处理群(图5中表示为“外泌体高(exosome high)”)：用混合黑色素合成刺激剂α-msh和高浓度的黑酵母来源的外泌体的培养基处理的实验群(颗粒数基准处理浓度：3.0x10
10
个颗粒/ml)。
91.将黑素瘤细胞培养48小时，然后回收培养液并用洗涤溶液(pbs；购自thermo fisher)洗涤黑素瘤细胞。
92.将上述回收的培养基与cck-8检测试剂(购自dojindo)混合，在5％co2、37℃条件下孵育(incubation)2小时，然后将上清液转移至96孔板中，在450nm处测定吸光度。另外，用混合10％dmso的1n naoh(购自merck-millipore)处理经洗涤的黑素瘤细胞，然后将板密封并在85℃下加热20分钟以提取黑素瘤细胞内的黑色素。对于提取的黑色素，在405nm处测定吸光度，从而计算黑色素量。
93.其结果，可以确认黑酵母来源的外泌体浓度依赖性地减少黑素瘤细胞的黑色素合成(图5)。
94.因此，本发明的含有黑酵母来源的外泌体作为有效成分的化妆料组合物具有美白效果，并且黑酵母来源的外泌体可以有效地用作用于改善肤色或皮肤亮度和/或美白皮肤的功能性化妆料组合物的有效成分。
95.实施例6：确认透明质酸合酶或水通道蛋白合成促进效果
96.将人角质形成细胞(hacat)以每孔2x105的浓度分株到6孔细胞培养板中，在包含10％胎牛血清的dmem培养基中培养24小时。之后，将培养基更换为不含10％fbs和钙(ca
2
)的dmem培养基，然后将黑酵母来源的外泌体在培养基中稀释并处理24小时。经过24小时后，回收细胞，用冷却的磷酸缓冲溶液(pbs)洗涤，并用rneasy mini试剂盒(qiagen，德国)提取总rna。以提取的rna为模板，用cdna合成试剂盒(philekorea，韩国)进行逆转录反应以合成cdna。合成的cdna定量后用水稀释，以等量用于所有反应。使用了universal master mix ii和gene expression assays(thermo fisher，美国)、has2引物(id:hs00193435_m1)和aqp3引物(id:hs01105469_g1)。使用实时pcr系统(applied biosystems，美国)进行了实时聚合酶链式反应(quantitative real time pcr)。
97.实验结果基于持家基因(housekeeping gene)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；gapdh)通过δδct方法计算并示出。以未处理黑酵母来源的外泌体的阴性对照群的mrna表达量为约1.0，在此基础上对各实验群的has2(透明质酸合酶2，hyaluronan synthase 2)和aqp3(水通道蛋白3，aquaporin 3)基因的表达程度进行数值化(表1至2)。
98.[表1]
[0099]
has2 mrna表达量
[0100][0101]
[表2]
[0102]
aqp3 mrna表达量
[0103][0104]
测定根据黑酵母来源的外泌体处理的透明质酸合酶has2基因表达程度的结果，由表1可以确认，与未处理黑酵母来源的外泌体的未处理群相比，处理黑酵母来源的外泌体时，确认了has2基因表达浓度依赖性地增加，并且确认了has2基因表达最多增加约3倍。
[0105]
另外，测定根据黑酵母来源的外泌体处理的跨膜蛋白即水通道蛋白3、aqp3基因表达程度的结果，由表2可以确认，与未处理黑酵母来源的外泌体的未处理群相比，处理黑酵母来源的外泌体时，确认了aqp3基因表达浓度依赖性地增加，并且确认了aqp3基因表达最多增加约4.5倍。
[0106]
因此，本发明的含有黑酵母来源的外泌体作为有效成分的化妆料组合物通过增加透明质酸或水通道蛋白的合成而具有保湿皮肤的效果，并且可以有效地用作皮肤保湿用化妆料组合物的有效成分。
[0107]
以上，列举上述实施例对本发明进行了描述，但本发明并不限于此。将可以理解的是，只要是本领域技术人员，则可以在不脱离本发明的主旨和范围的情况下进行修改、变更，并且这种修改和变更也属于本发明。