使用杂芳基联苯基酰胺衍生物治疗癌症的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年6月23日提交的美国临时申请序列号63/042,807的优先权权益，将其披露内容通过引用以其全文并入本文。
3.关于在联邦资助的研究和开发下
4.完成的发明的权利的声明
5.不适用
6.对以光盘递交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件的引用
7.不适用
背景技术：
8.程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)是cd28超家族的成员，在与其两个配体(pd-l1或pd-l2)相互作用时传递负信号。pd-1及其配体广泛地表达并在t细胞激活和耐受中发挥广泛的免疫调节作用。pd-1及其配体参与减弱传染性免疫和肿瘤免疫，并且促进慢性感染和肿瘤进展。
9.在多种人类疾病中，pd-1路径的调节有治疗潜力(hyun-tak jin等人,curr top microbiol immunol.[当前的微生物学与免疫学主题](2011)；350:17-37)。在癌症疗法中，pd-1路径的阻断已成为有吸引力的靶标。阻断程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)免疫检查点路径的治疗抗体防止t细胞下调并促进针对癌症的免疫应答。在多期临床试验中，几种pd-1路径抑制剂已显示出稳健的活性(rd harvey,clinical pharmacology and therapeutics[临床药理学与治疗学](2014)；96(2),214-223)。
[0010]
阻断pd-l1与pd-1或cd80相互作用的药剂是希望的。已经开发并商业化了一些抗体。已经公开了披露非肽小分子的一些专利申请(wo 2015/160641、wo 2015/034820、和wo 2017/066227以及来自bms的wo 2018/009505；来自aurigene公司的wo 2015/033299和wo 2015/033301；来自incyte公司的wo 2017/070089、us 2017/0145025、wo 2017/106634、us 2017/0174679、wo 2017/192961、wo 2017/222976、wo 2017/205464、wo 2017/112730、wo 2017/041899和wo 2018/013789，来自再极公司(maxinovel)的wo 2018/006795以及来自美国chemocentryx公司的wo 2018/005374)。然而，仍然需要作为pd-l1的抑制剂的，可以在口服施用、增加的肿瘤渗透性、稳定性、生物利用度、治疗指数、和毒性方面有有利的特征的替代性化合物(如小分子)。
技术实现要素：
[0011]
在一些方面，本文提供了治疗癌症的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的具有式(i)的化合物：
[0012][0013]
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r4、ra、和rb如本文所述。
[0014]
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：结肠癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、默克尔细胞癌、肝癌、乳腺癌、和头颈癌。
附图说明
[0015]
图1a-b绘制了化合物2.001(a)和2.002(b)的pd1/pd-l1结合elisa数据(上小图)和pd-1/pd-l1阻断基于细胞的测定数据(下小图)。
[0016]
图2a-c示出了在离体混合淋巴细胞反应(mlr)测定中化合物2.001如何促进人t细胞的同种异体免疫应答；示出了来自三个单独供体的t细胞的应答：供体#1(a)、供体#2(b)、和供体#3(c)。
[0017]
图3a-c示出了在离体混合淋巴细胞反应(mlr)测定中化合物2.002如何促进人t细胞的同种异体免疫应答；示出了来自三个单独供体的t细胞的应答：供体#1(a)、供体#2(b)、和供体#3(c)。
[0018]
图4a-b说明了化合物2.002(a，最左侧的柱)、化合物2.001(a，中间柱)、和对照化合物(a，最右侧的柱)的pbmc介导的肿瘤细胞杀伤。另外的对照实验使用了抗pd-l1抗体(德瓦鲁单抗)(b，最左侧的柱)和抗体同种型(b，最右侧的柱)。
[0019]
图5示出了化合物2.001和2.002诱导pd-l1二聚化，而抗pd-l1抗体和测试的对照不诱导。
[0020]
图6示出了在多个测试条件下在4℃(下小图)和37℃(上小图)下pd-l1的表面水平。此图证明特别地在37℃下化合物2.001和2.002降低表面pd-l1水平，这表明pd-l1内化。
[0021]
图7用于评估体内人pd-l1抑制剂的mc38-hpd-l1肿瘤模型。工程化的mc38-hpd-l1细胞适用于评估体内人pd-l1特异性抑制剂的作用：hpd-l1和mpd-l1以相似的亲和力与mpd-1结合；目前的hpd-l1抑制剂以相似的效力阻断hpd-l1与hpd-1或mpd-1相互作用(数据未显示)。mc38-hpd-l1细胞在小鼠中诱导肿瘤生长。
[0022]
图8a-c说明了在mc38-hpd-l1肿瘤模型中剂量依赖性方式的化合物2.002介导的肿瘤生长抑制。(a)绘制了肿瘤体积相对于肿瘤移植后的天数；(b)绘制了35天后的平均肿瘤重量；(c)绘制了给药3天后血浆化合物谷浓度。
[0023]
图9a-c绘制了在指定的天数媒介物处理(实心圆圈)和api(抗pd-l1抗体或指定的化合物，实心正方形)的肿瘤尺寸。测试的api是化合物2.001(a)、化合物2.003(b)和抗pd-l1抗体(c)。上小图绘制了每个治疗组的平均肿瘤尺寸，而下小图绘制了治疗组中每个小鼠的肿瘤尺寸。
[0024]
图10a-b绘制了在生物学实例2中所述的小鼠模型中，给药后12小时，给药6天后，化合物2.001(a)和化合物2.003(b)的血浆谷浓度。
[0025]
图11示出了当用抗pd-l1抗体(德瓦鲁单抗)、同种型抗体、化合物2.001、和媒介物处理时，细胞的人pd-l1染色。此分析中使用的pd-l1的检测抗体被与pd-l1结合的化合物2.001阻断。此图证明了化合物2.001处理的mc38-hpd-l1肿瘤几乎完全被化合物2.001占据。
[0026]
图12示出了在mc38-hpd-l1肿瘤模型中多种处理条件如何改变肿瘤浸润免疫细胞的量。下小图绘制了测量的cd8 t细胞的量；中小图绘制了测量的cd4
t细胞的量；并且上小图绘制了测量的cd8
和cd4
t细胞的量。
具体实施方式
[0027]
i.一般
[0028]
本披露提供了使用具有式(i)的化合物治疗特定癌症的方法。要求保护的化合物具有稳健的抗肿瘤性质，对pd-l1具有高亲和力。当施用时，这些化合物有效地破坏pd-1/pd-l1信号传导，并且在一些实施例中，诱导癌细胞上pd-l1的二聚化和内化。
[0029]
pd-1/pd-l1小分子调节剂的开发一直受到需要平衡多种因素的阻碍，这些因素包括：pd-1/pd-l1亲和力、化合物的疏水性/亲水性、生物清除率、和抗靶标活性(例如，cyp和herg抑制)。事实上，迄今为止，还没有批准用于口服施用的pd-1/pd-l1抑制剂。
[0030]
与iv药物配制品相比，除其他方面外，口服施用的化合物的生物利用度需要胃吸收和对通过门静脉循环到肝脏(称为“首过代谢”)的显著降解的抗性。在一些实施例中，本文所述的方法提供了在某些癌症的治疗中意外地适用于口服施用的pd-1/pd-l1调节剂。所述方法中的化合物不需要血液中极高浓度的化合物；相反，这些化合物在ng/ml范围内可以引发其抗肿瘤作用。
[0031]
ii.缩写和定义
[0032]
如本文所用的，术语“一个/一种(a或an)”或“该(the)”不仅包括一个成员的方面，也包括多于一个成员的方面。例如，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/一种”和“该”包括复数个指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”时包括多个/种这样的细胞，并且提及“该药剂”时包括提及本领域技术人员已知的一个或多个药剂，等。
[0033]
术语“约”和“大约”通常意指在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。典型的、示例性误差度是在给定值或值范围的20％(％)内，优选在10％内，并且更优选在5％内。可替代地，并且特别地在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指是在给定值的一个数量级内，优选在5倍以内，并且更优选在2倍以内的值。除非另外说明，否则本文给出的数字量是大约的，意指当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。
[0034]
除非另外说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指具有指定的碳原子数(即，c
1-8
意指一至八个碳)的直链或支链烃基的基团。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。术语“烯基”是指具有一个或多个双键的不饱和烷基基团。类似地，术语“炔基”是指具有一个或多个三键的不饱和烷基基团。烯基基团的实例包括乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基和3-(1,4-戊二烯基)。炔基基团的实例包括乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级的同系物和异构体。术语“环烷基”是指具有指定数目环原子(例如，c
3-6
环烷基)并且完全饱和或在环顶点之间具有不超过一个双键的烃环。“环
烷基”也是指双环和多环烃环，如例如，双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷等。双环或多环可以是稠合的、桥接的、螺环的或其组合。术语“杂环烷基”或“杂环基”是指含有选自n、o和s的一个至五个杂原子的环烷基基团，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环环系统。双环或多环可以是稠合的、桥接的、螺环的或其组合。应理解，c
4-12
杂环基的叙述是指具有从4至12个环成员的基团，其中至少一个环成员是杂原子。杂环烷基基团的非限制性实例包括吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑啉酮、四唑酮、乙内酰脲、二氧杂环戊烷、邻苯二甲酰亚胺、哌啶、1,4-二噁烷、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-s-氧化物、硫代吗啉-s,s-氧化物、哌嗪、吡喃、吡啶酮、3-吡咯啉、噻喃、吡喃酮、四氢呋喃、四氢噻吩、奎宁环等。杂环烷基基团可以通过环碳或杂原子附接至分子的其余部分。
[0035]
术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷烃的二价基团(如-ch2ch2ch2ch
2-所例示)。亚烷基基团可以是线性或分支的。后者的实例是-ch2c(ch3)2ch
2-、-ch2c(ch3)
2-或-ch(ch3)ch2ch
2-。典型地，烷基(或亚烷基)基团将具有1至12个碳原子，本披露中优选具有8个或更少个碳原子的那些基团。类似地，“亚烯基”和“亚炔基”是指分别具有双键或三键的“亚烷基”的不饱和形式。
[0036]
术语“烷氧基”、“烷氨基”以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，并且是指分别经由氧原子、氨基基团或硫原子连接至分子其余部分的那些烷基基团。另外，对于二烷基氨基基团来说，烷基部分可以是相同或不同的并且也可以与各自附接的氮原子结合形成3-7元环。因此，表示为-nrarb的基团意指包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、氮杂环庚烷等。
[0037]
除非另外说明，否则术语“卤代”或“卤素”单独或作为另一个取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语，如“卤代烷基”意指包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“c
1-4
卤代烷基”意指包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
[0038]
术语“羟基烷基”或“烷基-oh”是指如上定义的烷基基团，其中至少一个(且至多三个)氢原子被羟基基团替代。至于烷基基团，羟基烷基基团可以具有任何适合数量的碳原子，如c
1-6
。示例性羟基烷基基团包括但不限于羟基甲基、羟基乙基(其中羟基在1-或2-位)、羟基丙基(其中羟基在1-、2-或3-位)、和2,3-二羟基丙基。
[0039]
除非另外说明，否则术语“芳基”意指可以是单环或稠合在一起或共价连接的多个环(多至三个环)的多不饱和、典型地为芳香族的烃基。术语“杂芳基”是指含有从选自n、o和s的一个至五个杂原子的芳基基团(或环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基基团可以通过杂原子附接至分子的其余部分。应当理解，c
5-10
杂芳基的叙述是指具有从5至10个环成员的杂芳基部分，其中至少一个环成员是杂原子。芳基基团的非限制性实例包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基基团的非限制性实例包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基(pyrimindinyl)、三嗪基、喹啉基(quinolinyl)、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基(phthalazinyl)、苯并三嗪基、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、吲嗪基(indolizinyl)、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基(benzothiaxolyl)、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基(quinolyl)、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、
噻吩基等。每个上述芳基和杂芳基环系统的取代基选自如下所述的可接受的取代基的基团。
[0040]
术语“碳环(carbocyclic ring或carbocyclic)”或“碳环基”是指仅具有碳原子作为环顶点的环部分。碳环部分是饱和的或不饱和的并且可以是芳香族的。通常，碳环部分具有从3至10个环成员。具有多个环结构的碳环部分(例如，双环)可以包括稠合至芳香族环的环烷基环(例如，1,2,3,4-四氢萘)。因此，碳环包括环戊基、环己烯基、萘基、和1,2,3,4-四氢萘基。术语“杂环”是指“杂环烷基”和“杂芳基”部分两者。因此，杂环是饱和的或不饱和的并且可以是芳香族的。通常，杂环具有4至10个环成员并且包括哌啶基、四嗪基、吡唑基和吲哚基。
[0041]
当上述术语(例如，“烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的任一个被称为
‘
经取代的’而没有对取代基进一步注释时，指定基团的经取代的形式将如下提供。
[0042]
烷基基团(包括通常称为亚烷基、烯基、炔基和环烷基的那些基团)的取代基可以是选自以下的各种基团：-卤素、-or’、-nr’r”、-sr’、-sir’r”r
”’
、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr
’‑
c(o)nr”r
”’
、-nr”c(o)2r’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nr’s(o)2r”、-cn和-no2，数量的范围为从零至(2m’ 1)，其中m’是这样的基团中的碳原子的总数。r’、r”和r
”’
各自独立地是指氢、未经取代的c
1-8
烷基、未经取代的杂烷基、未经取代的芳基、经1-3个卤素取代的芳基、未经取代的c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基或c
1-8
硫代烷氧基基团、或未经取代的芳基-c
1-4
烷基基团。当r’和r”与相同氮原子附接时，可以与氮原子结合形成3-、4-、5-、6-、或7-元环。例如，-nr’r”意指包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“酰基”是指烷基基团，其中最靠近该基团的附接点的碳上的两个取代基被取代基＝o替代(例如，-c(o)ch3、-c(o)ch2ch2or’等)。
[0043]
类似地，芳基和杂芳基基团的取代基是多种多样的并且通常选自：-卤素、-or’、-oc(o)r’、-nr’r”、-sr’、-r’、-cn、-no2、-co2r’、-conr’r”、-c(o)r’、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr”c(o)2r’、-nr
’‑
c(o)nr”r
”’
、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nr’s(o)2r”、-n3、全氟(c
1-c4)烷氧基、和全氟(c
1-c4)烷基，芳香族环系统中开放价态的数量范围为在从零至总数；并且其中r’、r”和r
”’
独立地选自氢、c
1-8
烷基、c
3-6
环烷基、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、未经取代的芳基和杂芳基、(未经取代的芳基)-c
1-4
烷基、和未经取代的芳氧基-c
1-4
烷基。其他适合的取代基包括通过1-4个碳原子的亚烷基链的附接至环原子的以上芳基取代基中的每一个。
[0044]
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被具有式-t-c(o)-(ch2)
q-u-的取代基替代，其中t和u独立地是-nh-、-o-、-ch
2-或单键，并且q是从0至2的整数。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被具有式-a-(ch2)
r-b-的取代基替代，其中a和b独立地是-ch
2-、-o-、-nh-、-s-、-s(o)-、-s(o)
2-、-s(o)2nr
’‑
或单键，并且r是从1至3的整数。如此形成的新环的单键中的一个可以任选地被双键替代。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被具有式-(ch2)
s-x-(ch2)
t-的取代基替代，其中s和t独立地是从0至3的整数，并且x是-o-、-nr
’‑
、-s-、-s(o)-、-s(o)
2-、或-s(o)2nr
’‑
。-nr
’‑
和-s(o)2nr
’‑
中的取代基r’选自氢或未经取代的c
1-6
烷基。
[0045]
如本文所用，术语“杂原子”意指包括氧(o)、氮(n)、硫(s)以及硅(si)。
[0046]
本文的披露内容进一步涉及其前药和生物电子等排体。适合的生物电子等排体，例如，将包括羧酸酯替代物(膦酸、次磷酸、磺酸、亚磺酸、和酸性杂环基团如四唑)。适合的前药将包括已知在生理条件下水解和/或氧化以提供具有式i的化合物的那些常规的基团。
[0047]
术语“患者”和“受试者”包括灵长类动物(尤其是人类)、家养伴侣动物(如狗、猫、马等)和家畜(例如牛、猪、绵羊等)。
[0048]
如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”涵盖疾病改善治疗和症状性治疗两者，这些治疗中的任一者可以是预防性的(即，在症状发作之前，以预防、延迟或降低症状的严重性)或治疗性的(即，在症状发作之后，以降低症状的严重性和/或持续时间)。
[0049]
术语“药学上可接受的盐”意指包括活性化合物的盐，这些活性化合物根据本文所述的化合物上发现的特定取代基用相对无毒的酸或碱制备。当本披露的化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使这样的化合物的中性形式与足量的所希望的碱(纯碱或在合适的惰性溶剂中)接触来获得。衍生自药学上可接受的无机碱的盐的实例包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、二价锰、钾、钠、锌等。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，这些胺包括经取代的胺、环状胺、天然存在的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明盐(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。当本披露的化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使这样的化合物的中性形式与足量的所希望的酸(纯酸或在合适的惰性溶剂中)接触来获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸的那些，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，如乙酸、丙酸、异丁酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、杏仁酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐(例精氨酸盐等)和有机酸的盐，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸(galactunoric acid)等(参见，例如，berge,s.m.等人,“pharmaceutical salts[药物盐]”journal of pharmaceutical science[药物科学杂志],1977,66,1-19)。本披露的某些特定化合物既含有碱性官能团又含有酸性官能团，这使得化合物可以转化为碱加成盐或酸加成盐。
[0050]
化合物的中性形式可以通过使该盐与碱或酸接触并且以常规方式分离母体化合物而再生。化合物的母体形式在某些物理特性(例如在极性溶剂中的溶解度)方面不同于各种盐形式，但在其他方面，这些盐出于本披露的目的等效于化合物的母体形式。
[0051]
本披露的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。一般来讲，溶剂化形式等效于非溶剂化形式，并且旨在涵盖在本披露的范围内。本披露的某些化合物可以多种结晶或无定形形式存在。一般来讲，所有物理形式对于由本披露所设想的用途是等效的并且旨在属于本披露的范围内。
[0052]
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体、位置异构体以及个别异构体(例如，分离的对映异构体)全部旨在涵盖在本发明的范围内。当示出立体化学描绘时，它是指其中存在一种异构体并且基本上不含另一种异构体的化合物。“基本上不含”另一种异构体指示两种异构体的至少80/20比率、更优
选90/10、或95/5或更大。在一些实施例中，一种异构体将以至少99％的量存在。
[0053]
本披露的化合物还可以在构成这样的化合物的一个或多个原子上含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素如例如氚(3h)、碘-125(
125
i)或碳-14(
14
c)进行放射性标记。本披露的化合物的所有放射性或非放射性同位素变体均旨在涵盖在本披露的范围内。例如，可以制备化合物使得任何数目的氢原子被氘(2h)同位素替代。本披露的化合物还可以在构成这样的化合物的一个或多个原子上含有非天然比例的原子同位素。非天然比例的同位素可以定义为从自然中所发现的量至组成元素为100％所考虑原子的量。例如，化合物可以掺入放射性同位素，如例如氚(3h)、碘-125(
125
i)或碳-14(
14
c)，或非放射性同位素，如氘(2h)或碳-13(
13
c)。这样的同位素变体可以为本技术内别处描述的那些提供额外效用。例如，本披露的化合物的同位素变体可以找到另外的效用，包括但不限于作为诊断和/或成像试剂、或者作为细胞毒性/放射毒性的治疗剂。另外，本披露的化合物的同位素变体可以具有可以有助于增强治疗过程中的安全性、耐受性或功效的改变的药代动力学和药效动力学特征。本披露的化合物的所有放射性或非放射性同位素变体均旨在涵盖在本披露的范围内。
[0054]
iii.本披露的实施例
[0055]
治疗方法
[0056]
在一些方面，本文提供了治疗癌症的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的具有式(i)的化合物：
[0057][0058]
或其药学上可接受的盐，其中：
[0059]
r1和r2各自独立地选自由以下组成的组：f、cl、ch3、和cf3；
[0060]
r3选自由以下组成的组：f、cl、ch3、cf3、
–o–
ch3、和
–o–
cf3；
[0061]
r4选自由
–
y和
–
x1–
y组成的组，其中每个x1是c
1-4
亚烷基，并且y选自由以下组成的组：c
3-6
环烷基，具有独立地选自由n、o、和s组成的组的1至3个杂原子环顶点的c
4-6
杂环烷基，和具有独立地选自由n、o、和s组成的组的1至3个杂原子环顶点的5至6元杂芳基，其各自未经取代或经一个至两个取代基取代，该一个至两个取代基独立地选自由以下组成的组：氧代、oh、c
1-4
烷基、c
1-4
卤代烷基、c
1-4
羟基烷基、c
1-4
烷氧基、c
1-4
卤代烷氧基、和c
1-4
羟基烷氧基；并且
[0062]
ra和rb独立地选自由以下组成的组：h、c
1-3
烷基、和c
1-4
卤代烷基。
[0063]
在一些实施例中，r1选自由cl和ch3组成的组。在一些实施例中，r1是cl。在一些实施例中，r1是ch3。
[0064]
在一些实施例中，r2选自由cl和ch3组成的组。在一些实施例中，r2是cl。在一些实施例中，r2是ch3。
[0065]
在一些实施例中，r3选自由
–o–
ch3和
–o–
cf3组成的组。在一些实施例中，r3是
–o–
ch3。在一些实施例中，r3是
–o–
cf3。
[0066]
在一些实施例中，ra选自由以下组成的组：h、ch3、和cf3。在一些实施例中，ra是ch3。
[0067]
在一些实施例中，rb选自由以下组成的组：h、ch3、和cf3。在一些实施例中，rb是ch3。
[0068]
在一些实施例中，具有式i的化合物具有式(ia)：
[0069][0070]
或其药学上可接受的盐。
[0071]
在一些实施例中，
–
nh(r4)选自由以下组成的组：
[0072][0073]
在一些实施例中，
–
nh(r4)选自由
[0074]
组成的组。
[0075]
在一些实施例中，
–
nhr4选自由以下组成的组：
[0076][0077]
在一些实施例中，
–
nhr4是
[0078][0079]
在一些实施例中，具有式(i)的化合物是光学纯或富集的异构体。
[0080]
在一些实施例中，具有式(i)的化合物选自表1中的化合物。
[0081]
如本文所述，用于治疗某些癌症的披露的方法不需要在血液中具有极高浓度的具有式(i)的化合物。相反，这些化合物足以在较低血浆浓度下有效提供治疗益处。因此，在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过1,000ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过750ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过500ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过400ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过300ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过200ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在不超过100ng/ml。
[0082]
在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在约2ng/ml至1,000ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在约5ng/ml至500ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在约10ng/ml至400ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在约20ng/ml至300ng/ml。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物将血浆谷浓度维持在约40ng/ml至200ng/ml。
[0083]
可使用本文所述的方法治疗多种癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、成胶质细胞瘤、食道肿瘤、鼻咽癌、葡萄膜黑色素瘤、淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、慢性髓细胞性白血病、卡波西肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、脑膜瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、肉瘤、脓毒症、胆管肿瘤、基底细胞癌、胸腺赘生物、甲状腺癌、甲状旁腺癌、子宫癌、肾上腺癌、肝脏感染、默克尔细胞癌、神经肿瘤、滤泡中心性淋巴瘤、结肠癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病、慢性或急性白血病(包括急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、卵巢肿瘤、骨髓增生异常综合征、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、肾细胞癌、小细胞肺癌、肺癌、间皮瘤、肝癌、乳腺癌、鳞状非
小细胞肺癌(sclc)、非鳞状nsclc、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌(pancreatic carcinoma和pancreatic cancer)、胰腺导管腺癌、头颈鳞状细胞癌、头颈癌、胃肠道胃癌、hiv、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、疱疹病毒、乳头瘤病毒、流感、骨癌、皮肤癌、直肠癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)赘生物、肿瘤血管生长、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、石棉肺、癌、腺癌、乳头状癌、囊腺癌、支气管癌、肾细胞癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、多形性腺瘤、肝细胞乳头状瘤、肾小管腺瘤、囊腺瘤、乳头状瘤、腺瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、血管瘤、淋巴管瘤、骨瘤、软骨瘤、脂肪瘤和纤维瘤。在一些实施例中，每个列出的癌症均是pd-l1阳性癌症。
[0084]
在一些实施例中，癌症是结肠癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、默克尔细胞癌、肝癌、乳腺癌、和头颈癌。在一些实施例中，每个列出的癌症均是pd-l1阳性癌症。
[0085]
在一些实施例中，疾病或障碍是结肠癌。在一些实施例中，癌症是肾癌。在一些实施例中，癌症是结直肠癌。在一些实施例中，癌症是胃癌。在一些实施例中，癌症是膀胱癌。在一些实施例中，癌症是黑色素瘤。在一些实施例中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施例中，癌症是肝癌。在一些实施例中，癌症是乳腺癌。在一些实施例中，每个列出的癌症均是pd-l1阳性癌症。
[0086]
在一些实施例中，将有效量的一种或多种另外的治疗剂进一步施用于受试者。在一些实施例中，一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：细胞毒性剂、基因表达调节剂、化学治疗剂、抗癌剂、抗血管生成剂、免疫治疗剂、抗激素剂、放射疗法、放射治疗剂、抗肿瘤剂、和抗增殖剂。在一些实施例中，一种或多种另外的治疗剂是趋化因子和/或趋化受体的拮抗剂，其包括但不限于ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、ccr11、ccr12、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cxcr7、c3ar、和/或c5ar。趋化因子和/或趋化受体拮抗剂是本领域已知的并且描述于，例如，wo 2007/002667、wo 2007/002293、wo/2003/105853、wo/2007/022257、wo/2007/059108、wo/2007/044804、wo 2007/115232、wo 2007/115231、wo 2008/147815、wo 2010/030815、wo 2010/075257、wo 2011/163640、wo 2010/054006、wo 2010/051561、wo 2011/035332、wo 2013/082490、wo 2013/082429、wo 2014/085490、wo 2014/100735、wo 2014/089495、wo 2015/084842、wo 2016/187393、wo 2017/127409、wo 2017/087607、wo 2017/087610、wo 2017/176620、wo 2018/222598、wo 2018/222601、wo 2013/130811、wo 2006/076644、wo 2008/008431、wo 2009/038847、wo 2008/008375、wo 2008/008374、wo 2008/010934、wo 2009/009740、wo 2005/112925、wo 2005/112916、wo 2005/113513、wo 2004/085384、wo 2004/046092中。趋化因子和/或趋化受体拮抗剂还包括ccx354、ccx9588、ccx140、ccx872、ccx598、ccx6239、ccx9664、ccx2553、ccx3587、ccx3624、ccx 2991、ccx282、ccx025、ccx507、ccx430、ccx765、ccx224、ccx662、ccx650、ccx832、ccx168、ccx168-m1、ccx3022和/或ccx3384。
[0087]
通常，本文提供的治疗方法包括向患者施用有效量的本文提供的一种或多种化合物。适合的患者包括患有或易患(即，预防性治疗)本文鉴定的障碍或疾病的那些患者。如本文所述用于治疗的典型患者包括哺乳动物，特别地灵长类动物，尤其是人类。其他适合的患
者包括家养伴侣动物(如狗、猫、马等)或家畜动物(例如牛、猪、绵羊等)。
[0088]
施用途径及剂量
[0089]
本披露设想的施用途径包括本领域已知的用于递送治疗癌症的活性剂的那些。这包括但不限于口服施用、肿瘤内注射、静脉内施用和皮下注射。在一些实施例中，口服施用有效量的具有式(i)的化合物。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物经由肿瘤内注射施用。在一些实施例中，静脉内施用有效量的具有式(i)的化合物。在一些实施例中，有效量的具有式(i)的化合物经由皮下注射施用。
[0090]
通常，本文提供的治疗方法包括向患者施用有效量的具有式(i)的化合物或本文提供的一种或多种化合物。有效量可以是足以在受试者中调节pd-1/pd-l1相互作用、减缓肿瘤生长、抑制肿瘤生长、和/或减小肿瘤尺寸的量。优选地，施用的量足以产生足够高的化合物(或其活性代谢物，如果化合物是前药)的血浆浓度，以充分调节pd-1/pd-l1相互作用。治疗方案可以根据使用的化合物和待治疗的特定病症而变化；对于大多数障碍的治疗，每天4次或更少的施用频率是优选的。通常，每天2次的剂量方案是更优选的，每天一次的给药是特别优选的。然而，应当理解，针对任何特定患者的特定剂量水平和治疗方案将取决于多种因素，这些因素包括应用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、药物组合(即，向患者施用的其他药物)和经历疗法的特定疾病的严重程度、以及开方的执业医师的判断。通常，使用足以提供有效疗法的最小剂量是优选的。通常可以使用适用于待治疗或预防的病症的医学或兽医标准监测患者的治疗有效性。
[0091]
约0.1mg至约140mg/天/千克体重级别的剂量水平在治疗或预防涉及pd-1/pd-l1相互作用的病症中是有用的(每位人类患者每天约0.5mg至约7g)。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主以及特定施用模式而变化。单位剂型通常将含有约1mg至约500mg之间的活性成分。对于口服、经皮、静脉内、或皮下施用的化合物，优选的是，施用足量的化合物以实现5ng(纳克)/ml-1μg(微克)/ml血浆的血浆浓度，更优选地，应施用足量的化合物以实现20ng-0.5μg/ml血浆的血浆浓度，最优选地，应施用足量的化合物以实现30ng/ml-200ng/ml血浆的血浆浓度。
[0092]
剂量的频率也可以根据使用的化合物、施用的途径、和治疗的特定疾病变化。然而，对于大多数障碍的治疗，每天4次，每天3次或更少的治疗方案是优选的，其中每天一次或2次的治疗方案是特别优选的。然而，应当理解，针对任何特定患者的特定剂量水平将取决于多种因素，这些因素包括应用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径、和排泄率、药物组合(即，向患者施用的其他药物)、经历疗法的特定疾病的严重程度、和其他因素，包括开方的执业医师的判断。
[0093]
药物组合物
[0094]
当施用于受试者时，式(i)典型地在药物组合物中。如本文所用，术语“组合物”意图涵盖以所说明的量包括所说明的成分的产品，以及以所说明的量直接或间接获自所说明的成分的组合的任何产品。“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与配制品的其他组分相容并且对其接受者无害。
[0095]
用于施用本披露的化合物的药物组合物可以常规地以单位剂形存在来口服施用，并且可以通过药学和药物递送领域中熟知的任何方法来制备。所有方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，药物组合物通过以下步骤制备：使活性
成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀并且紧密地缔合，然后如果需要的话，使产物成形为所希望的配制品。活性目标化合物以足够对疾病的过程或病症产生所希望的作用的量包括在该药物组合物中。
[0096]
含有活性成分的药物组合物可以呈适用于口服使用的形式，例如，作为片剂、糖剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散性粉剂或颗粒剂、乳剂和自乳化剂(self-emulsifications)(如在美国专利申请2002-0012680中所述的)、硬胶囊剂或软胶囊剂、糖浆剂、酏剂、溶液剂、口腔贴剂、口服凝胶剂、口香糖、可咀嚼片剂、泡腾粉剂和泡腾片剂。旨在用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且为了提供药学上精致的并且适口的制剂，这样的组合物可以含有选自由以下组成的组的一种或多种药剂：甜味剂、调味剂、着色剂、抗氧化剂和防腐剂。片剂含有活性成分，该活性成分与无毒的药学上可接受的、适用于生产片剂的赋形剂混合。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释剂，例如纤维素、二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、碳酸钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如pvp、纤维素、peg、淀粉、明胶或阿拉伯胶和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的或者通过已知技术进行经肠溶或者以其他方式包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且从而在较长的时间段内提供持久的作用。例如，可以采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。他们也可以通过美国专利号4,256,108；4,166,452；和4,265,874中所述的技术进行包衣以形成用于控制释放的渗透治疗片剂。
[0097]
用于口服使用的配制品也可以以硬明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)、各种平均尺寸的聚乙二醇(peg)(例如，peg400、peg4000)，和某些表面活性剂(如克列莫佛或solutol)混合，或者以软明胶胶囊的形式呈现，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡、或橄榄油)混合。另外，乳剂可以用无水混溶性成分(如油)制备并用表面活性剂(如甘油单酯或甘油二酯、peg酯等)稳定。
[0098]
水性悬浮液含有与适用于制造水性悬浮液的辅料相混合的活性物质。这样的赋形剂是助悬剂，例如，羧甲纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七亚乙基氧基鲸蜡醇)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂、和一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
[0099]
可以通过将活性成分悬浮于植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油、或椰子油，或矿物油中，如液体石蜡中来配制油性悬浮液。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂例如以上所阐述的那些，和调味剂来提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存。
[0100]
通过添加水，适用于制备水性悬浮液的可分散粉和颗粒提供了与分散剂或湿润剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散或润湿剂和助悬剂诸如上文已经提及的那些。也可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
[0101]
本披露的药物组合物也可以呈水包油乳剂的形式。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)，或矿物油(例如液态石蜡)，或这些物质的混合物。适合的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如单油酸山梨聚糖，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯单油酸山梨聚糖。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。
[0102]
可以用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖来配制糖浆和酏剂。这样的制剂还可以含有润药剂、防腐剂和调味剂和着色剂。口服溶液可以与例如，环糊精、peg和表面活性剂组合制备。
[0103]
本披露的化合物也可以与作为靶向药物载体的适合的聚合物的载体偶合。这样的聚合物可以包括聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基-丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基-天冬酰胺(aspartamide)-苯酚、或经棕榈酰基残基取代的聚乙烯氧化物-聚赖氨酸。此外，本披露的化合物可以偶合到载体，该载体是用于实现药物的控制释放的一类生物可降解聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。聚合物和半透性聚合物基质可以形成成形制品，例如阀、支架、管道、假体等。在本披露的一个实施例中，本披露的化合物与形成支架或支架移植物装置的聚合物和半透性聚合物基质偶合。
[0104]
在一些实施例中，药物组合物进一步包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施例中，一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：抗微生物剂、抗病毒剂、细胞毒性剂、基因表达调节剂、化学治疗剂、抗癌剂、抗血管生成剂、免疫治疗剂、抗激素剂、抗纤维化剂、放射疗法、放射治疗剂、抗瘤剂、和抗增殖剂。在一些实施例中，一种或多种另外的治疗剂是趋化因子和/或趋化受体的拮抗剂，其包括但不限于ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、ccr11、ccr12、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cxcr7、c3ar、和/或c5ar。趋化因子和/或趋化受体拮抗剂是本领域已知的并且描述于，例如，wo 2007/002667、wo 2007/002293、wo/2003/105853、wo/2007/022257、wo/2007/059108、wo/2007/044804、wo 2007/115232、wo 2007/115231、wo 2008/147815、wo 2010/030815、wo 2010/075257、wo 2011/163640、wo 2010/054006、wo 2010/051561、wo 2011/035332、wo 2013/082490、wo 2013/082429、wo 2014/085490、wo 2014/100735、wo 2014/089495、wo 2015/084842、wo 2016/187393、wo 2017/127409、wo 2017/087607、wo 2017/087610、wo 2017/176620、wo 2018/222598、wo 2018/222601、wo 2013/130811、wo 2006/076644、wo 2008/008431、wo 2009/038847、wo 2008/008375、wo 2008/008374、wo 2008/010934、wo 2009/009740、wo 2005/112925、wo 2005/112916、wo 2005/113513、wo 2004/085384、wo 2004/046092中。趋化因子和/或趋化受体拮抗剂还包括ccx354、ccx9588、ccx140、ccx872、ccx598、ccx6239、ccx9664、ccx2553、ccx3587、ccx3624、ccx 2991、ccx282、ccx025、ccx507、ccx430、ccx765、ccx224、ccx662、ccx650、ccx832、ccx168、ccx168-m1、ccx3022和/或ccx3384。
[0105]
实例
[0106]
以下实例说明了制备本披露的化合物(包括具有式(i)或(ia)的化合物)的多种方法。提供以下实例以说明，但不限制要求保护的本披露。
[0107]
以下使用的试剂和溶剂可以从商业来源获得，如奥德里奇化工公司(aldrich chemical co)(密尔沃基市，威斯康星州，美国)。在瓦里安mercury 400mhz nmr光谱仪上记录1h-nmr光谱。提供了相对于tms的显著峰并按以下顺序制表：多重性(s，单重峰；d，双重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰)和质子数。质谱结果报告为质荷比。在实例中，报告了含有最常见的原子同位素的m h(或者，如所述的，m-h)离子的单个m/z值。在所有情况下，同位素模式对应于期望的式。在使用hp1100 hplc(用于样品递送)的惠普msd电喷雾质谱仪上进行电喷雾电离(esi)质谱分析。通常，将分析物以0.1mg/ml溶解于甲醇或ch3cn中，并将1微升的混合物与递送溶液输注入质谱仪，质谱仪扫描100至1000道尔顿。所有化合物均可以在阳性或阴性esi模式下，使用具有1％甲酸的乙腈/水作为递送溶液进行分析。
[0108]
以下缩写用于实例和整个披露说明中：tlc意指薄层色谱法。
[0109]
可以如下文所述使用本领域技术人员已知的多种反应合成本披露范围内的化合物。本领域技术人员也将认识到，可以采用可替代方法来合成本披露的目标化合物，并且本文档的主体中描述的方法不详尽，但确实为目的化合物提供了广泛适用和实用的途径。
[0110]
此专利中要求保护的某些分子可以以不同的对映异构体和非对映异构体形式存在并且要求保护这些化合物的所有这样的变体，除非指定特定的对映异构体。
[0111]
在本文中用于合成关键化合物的实验程序的详细描述导致通过识别分子的物理数据以及与分子相关联的结构描绘描述分子。
[0112]
本领域技术人员还将认识到，有机化学中在标准后处理程序期间，常使用酸和碱。在本专利中描述的实验程序期间，如果母体化合物具有必要的固有酸度或碱度，有时生产这些母体化合物的盐。
[0113]
实例1：n-(2'-氯-3'-(5-((((3r,4r)-3-羟基四氢-2h-吡喃-4-基)氨基)甲基)-6-甲氧基吡啶-2-基)-2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺
[0114][0115]
步骤a：向1,3-二甲基-n-(2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基)-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺(3.6g，9.0mmol)、1,3-二溴-2-氯苯(6.9g，25.5mmol)、和k2co3(3.8g，27.5mmol)在对二噁烷(40ml)和di h2o(6ml)中的混合物中添加具有二氯甲烷的pd(dppf)cl2络合物(912mg，1.12mmol)。将反应混合物脱气(n2)2min并在n2下在90℃下搅拌2h。将反应混合物用etoac稀释，通过celite过滤，用盐水洗涤并经mgso4干燥。将溶剂在减压下除去并将残余物通过快速硅胶色谱法(己烷中的5％至100％etoac，随后etoac中的0％至5％ meoh)纯化以给出n-(3'-溴-2'-氯-2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺。c
20h18
brcln3o3的ms:(es)m/z计算值：[m h]
462.0，发现值：462.0。
[0116]
步骤b：向n-(3'-溴-2'-氯-2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧
甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺和(s)-5-氨基甲基吡咯烷-2-酮盐酸盐制备标题化合物。将粗产物通过反相hplc(c18柱，具有0.1％ tfa的乙腈/h2o作为洗脱液)纯化以给出希望的产物(s)-n-(2'-氯-3'-(6-甲氧基-5-((((5-氧代吡咯啶-2-基)甲基)氨基)甲基)吡啶-2-基)-2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺。1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.63(d,j＝1.1hz,1h),8.12(dd,j＝7.9,1.3hz,1h),7.88(d,j＝7.6hz,1h),7.61(d,j＝7.7hz,1h),7.50(t,j＝7.6hz,1h),7.41
–
7.25(m,3h),7.00(d,j＝7.5hz,1h),4.34(d,j＝2.0hz,2h),4.13
–
4.00(m,4h),3.55(d,j＝1.0hz,3h),3.39(d,j＝1.0hz,3h),3.34
–
3.22(m,2h),2.49
–
2.32(m,3h),2.13(s,3h),1.92(q,j＝7.5hz,1h)。c
32h33
cln6o5的ms:(es)m/z计算值：[m h]
617.2，发现值：617.2。
[0122]
实例3：(s)-n-(2,2'-二氯-3'-(6-甲氧基-5-((((5-氧代吡咯啶-2-基)甲基)氨基)甲基)吡啶-2-基)-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺
[0123][0124]
使用与实例1类似的程序由n-(2,2'-二氯-3'-(5-甲酰基-6-甲氧基吡啶-2-基)-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺和(s)-5-(氨基甲基)吡咯烷-2-酮盐酸盐制备标题化合物。将粗产物通过制备型hplc(c18柱，具有0.1％ tfa的mecn/h2o作为洗脱液)纯化以给出(s)-n-(2,2'-二氯-3'-(6-甲氧基-5-((((5-氧代吡咯啶-2-基)甲基)氨基)甲基)吡啶-2-基)-[1,1'-联苯基]-3-基)-1,3-二甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-甲酰胺。1h nmr(400mhz,cd3od)δ11.69(s,1h),8.66(s,1h),8.54(d,j＝8.3hz,1h),7.93
–
7.85(m,1h),7.65(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.51(dd,j＝7.7,7.7hz,1h),7.45
–
7.35(m,3h),7.10(d,j＝7.6hz,1h),4.34(s,2h),4.14
–
4.01(m,4h),3.56(d,j＝1.6hz,3h),3.39(d,j＝1.8hz,3h),3.30
–
3.20(m,3h),2.40(dd,j＝11.8,11.1hz,2h),2.03(d,j＝1.7hz,1h),1.92(d,j＝6.9hz,1h)。c
31h31
cl2n6o5的ms:(es)m/z计算值：[m h]
637.2，发现值：637.2。
[0125]
生物学实例1：酶联免疫吸附测定
–
elisa
[0126]
在4℃下，将96孔板用pbs中的1μg/ml的人pd-l1(获得自r&d)包被过夜。然后在37℃下，将孔用具有0.05％吐温-20的pbs中的2％ bsa(w/v)阻断1小时。将板用pbs/0.05％吐温-20洗涤3次并将化合物在稀释液培养基中连续稀释(1:5)并添加至elisa板。添加人pd-1和生物素0.3μg/ml(acro生物系统公司(acro biosystems))并在37℃下孵育1小时，然后用pbs/0.05％吐温-20洗涤3次。在37℃下用pbs中的2％ bsa(w/v)/0.05％吐温-20进行第二次阻断10min，并将板用pbs/0.05％吐温-20洗涤3次。在37℃下添加链霉亲和素
–
hrp 1小时，然后将板用pbs/0.05％吐温-20洗涤3次。在37℃下，添加tmb底物并反应20min。添加终止溶液(2n水性h2so4)。使用微板分光光度计在450nm读取吸光度。结果如表1所示：ic
50
值提供如下：从1000至10,000nm( )；从10至1000nm( )；小于10nm( )。
inc.)，圣路易斯，密苏里州)的stemcell sepmate
tm-50管(干细胞科技公司(stemcell technologies)，温哥华，加拿大)通过密度梯度离心从健康供体从lrs室(去白细胞系统(leukoreduction system))从血沉棕黄层分离外周血单核细胞(pbmc)。
[0135]
单核细胞衍生的树突细胞的产生：通过使用人cd14
微珠(macs美天旎生物科技公司(macs miltenyi biotech)，贝吉施格拉德巴赫，德国)和pro分离器通过磁性分离从pbmc分离cd14
单核细胞。将分离的单核细胞以1x106个细胞/ml铺板并通过添加gm-csf(100ng/ml)和il-4(50ng/ml)持续6天分化为树突细胞。在第0天和第2天添加具有细胞因子补充剂的新鲜培养基。通过添加il-6(2000iu/ml)、il-1b(400iu/ml)(派普泰克公司(peprotech,inc.)，洛基山，新泽西州)、tnfα(2000iu/ml)和pge2(2ug/ml)(西格玛奥德里奇公司)在第6天诱导成熟的树突细胞并培养24小时。
[0136]
人效应细胞的制备：使用人cd4
微珠(macs美天旎生物科技公司)和pro分离器通过磁性分离从pbmc分离cd4
t细胞。
[0137]
混合淋巴细胞反应(mlr)：将来自不匹配的供体的dc和cd4
t细胞在96孔平底板(赛默飞世尔科技公司(thermo scientific))上以1:10的比率一起培养5天。如指示的，以1μm的起始浓度与具有dmso的1:4稀释液添加测试化合物。分别使用pd-l1抗体(az medi4736类似物)和同种型对照(人igg1，κ同种型对照)(皇冠生物公司(crownbio)，北京)作为阳性和阴性对照。在孵育5天后收获上清液并根据制造商的说明书，使用人ifn-γduoset elisa(r&d系统公司(r&d systems)，明尼阿波里斯市)通过elisa进行人ifng的检测。
[0138]
体外免疫疗法效力测定：在含有1ug/ml的嘌呤霉素的完全培养基中(dmem 10％ fbs p/s 1x)生长a375-egfp-puro细胞(atcc)。使用含有ficoll-paque plus(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)的stemcell sepmate
tm-50管(干细胞科技公司，温哥华，加拿大)通过密度梯度离心从健康供体从lrs室(去白细胞系统)从血沉棕黄层分离人外周血单核细胞(hpbmc)。将新鲜分离的hpbmc用100ng/ml的葡萄球菌肠毒素b(seb)(emd密理博公司(emd密理博公司)，目录号324798)刺激三天。将细胞洗涤两次并重悬至常规生长培养基。将3x104个a375-egfp-puro细胞接种在96孔透明底黑色tc处理板(最终体积为100ul)(康宁公司(corning))中。将测试化合物或抗人pd-l1抗体(az medi4736类似物，皇冠生物公司，北京)以不同浓度添加至孔中。将seb刺激的hpbmc以2:1的e:t(效应细胞:靶细胞)比率添加至孔。在37℃下在5％ co2中，将混合细胞孵育96至120小时。仔细吸取培养基并将100μl的pbs 1x添加至每个孔中。使用flexstation 3读板仪检测来自a375-egfp细胞的荧光。
[0139]
二聚化测定使用二聚化测定(迪斯卡沃雷克斯公司(discoverx)，费利蒙市，加利福尼亚州)通过化学发光检测在体外评估pd-l1蛋白二聚化。按照供应商方案进行测定。在最终体积为100ul的96孔白色底tc处理板(costar公司，圣何塞，加利福尼亚州)中铺板2x104个u2os细胞。将chemocentryx化合物或抗人pd-l1抗体(az medi4736类似物，皇冠生物公司，北京)以不同浓度添加至实验细胞中，并在37℃下在5％ co2中孵育16小时。将110ul的pathhunter快速检测试剂(迪斯卡沃雷克斯公司)添加至每个孔并在室温下在黑暗中孵育1小时。以100ms/孔的速度在flexstation 3读板仪(分子设备有限责任公司(molecular devices)，圣何塞，加利福尼亚州)上测量化学发光信号。
[0140]
内化测定：将在37℃下在5％ co2中生长的mc38-hpd-l1细胞(genoway公司，欧巴涅，法国)和rko细胞(atcc)分离，重悬在冷的facs缓冲液中(具有10％ fbs和0.1％叠氮化
物的pbs 1x)，并以10x104个细胞/孔的浓度添加至96孔测定板(v底)(爱思进公司(axygen)，联合市，加利福尼亚州)中。将chemocentryx化合物或抗人pd-l1抗体(az medi4736类似物)以不同浓度添加至孔中并在37℃或在4℃下孵育2小时。将细胞用冰冷的facs缓冲液洗涤两次并用重组兔单克隆抗人pd-l1抗体([28-8](pe)(ab209962)，艾博抗公司(abcam))或重组兔单克隆igg同种型对照([epr25a](pe)(ab209478)，艾博抗公司)在冰上染色30分钟。进行facs分析前，将细胞用facs缓冲液洗涤两次。使用flowjo软件来分析数据。
[0141]
mc38-hpd-l1细胞的产生和培养：仅已知这些化合物与人pd-l1交叉反应，因此使用具有表达人pd-l1(mc38-hpd-l1肿瘤模型)的鼠mc-38克隆肿瘤细胞的同系肿瘤模型。通过genoway生成mc38-hpd-l1细胞。首先使用crispr科技在mc38细胞中敲除内源性小鼠pd-l1，然后在这些小鼠pd-l1敲除mc38细胞中稳定转染人pdl1。在标准条件下，将mc38-hpd-l1细胞培养为具有g418的mc38细胞(具有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的dmem)以维持转基因表达。将这些细胞接种至小鼠的2天前，将细胞胰蛋白酶化并在没有抗生素的情况下接种。
[0142]
体内研究：向8周龄，雌性c57bl/6小鼠的右侧腹皮下注射5x 105个mc38-hpd-l1细胞。肿瘤接种后9天，基于肿瘤尺寸将小鼠随机分配至治疗组。仅将具有可测量肿瘤的小鼠纳入研究。以100ug/只小鼠/个剂量每周两次腹膜内给予抗pd-l1(德瓦鲁单抗)或同种型对照2周。将悬浮在1％ hpmc的化合物2.001和化合物2.002以指定剂量每天口服给药，每只小鼠给药100μl体积。将媒介物(1％ hpmc)以相同体积和相同频率给药至对照动物。
[0143]
使用数字卡尺每周三次测量肿瘤体积并计算为(宽度2*长度/2)。根据iacuc指南，当肿瘤体积到达2,000mm3时处死小鼠。
[0144]
使用卡尺每周测量3次肿瘤宽度(w)和长度(l)，并使用式v＝(w(2)x l)/2计算肿瘤体积。当肿瘤到达2000mm3时处死小鼠并切除肿瘤以用于进一步分析。
[0145]
肿瘤浸润物的细胞表型：将切除的肿瘤用刀片切碎并通过200um筛过网。然后将细胞通过70μm筛过滤。将细胞洗涤并重悬于facs缓冲液(具有10％ fbs和0.1％叠氮化物的pbs 1x)中。
[0146]
用于流式细胞术的抗体获得自生物传奇公司(biolegend)(圣地亚哥市，加利福尼亚州)。流式细胞仪组包括fitc中的cd45、pe中的pd-l1、apc中的cd8、apc-cy7中的cd4。用facscanto ii(bd生物科学公司(bd biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)细胞仪获得流式细胞术数据，并使用flowjo v10.2(flowjo，阿什兰，俄勒冈州)分析。
[0147]
结果：
[0148]
在酶联免疫吸附测定(elisa)中，化合物2.001和2.002两者均有效抑制pd-l1与pd-1的直接相互作用。来自多个测定的2.001和2.002的平均ic
50
分别为0.3nm和0.4nm(图1)。在评估pd-1介导的下游信号传导的基于细胞的测定中，这些化合物增强被pd-l1/pd-1相互作用抑制的nfat启动子驱动的萤光素酶表达。在此测定中，化合物2.001和2.002的平均ec
50
分别为52nm和46nm。
[0149]
在混合淋巴细胞反应(mlr)测定(图2和图3)中，化合物2.001和化合物2.002剂量依赖性地增加来自人t细胞的infγ的释放。来自不同供体的t细胞的应答不同，但对不同t细胞，两种化合物均显示出小于100nm的ec
50
。
[0150]
在存在预刺激的原代人pbmc的情况下，化合物2.001和2.002促进gfp标记的人癌细胞系a375的杀伤(图4a)。在此研究中，德瓦鲁单抗(fda批准的抗pd-l1抗体)用作阳性对照和对照物(图4b)。
[0151]
在pathhunter测定(二聚化测定)中，2种pd-l1分子的二聚化会将2个酶亚基结合在一起并形成功能性酶，该功能性酶产生生物发光信号。化合物2.001和2.002两者均强烈地诱导二聚化信号，而对照化合物和抗pd-l1抗体不诱导这样的信号(图5)。
[0152]
通过流式细胞术测量肿瘤细胞系上的表面pd-l1。检测抗体与pd-l1的结合不受小分子抑制剂的影响，如通过在4℃下用化合物处理的染色pd-l1的微小变化所示。在37℃下(允许受体内化的温度)，化合物2.001和2.002显著降低细胞表面的表面pd-l1水平(图6)。抗pd-l1抗体对pd-l1表面水平没有影响。这些事实表明化合物2.001和2.002促进pd-l1内化。
[0153]
小鼠肿瘤细胞系(mc38)(其中小鼠pd-l1被人pd-l1转基因替代)用于诱导小鼠中的肿瘤生长(图7)。我们证实了人和小鼠pd-l1以类似的亲和力与小鼠pd-1结合，并且我们的pd-l1抑制剂以类似的效力阻断人pd-l1与小鼠pd-1的相互作用(数据未显示)。
[0154]
在此模型中，口服给药的化合物2.002剂量依赖性地抑制肿瘤生长(图8a-c)。用30mg/kg(每日两次)治疗十只小鼠中的八只化合物2.002实现了肿瘤的完全根除(图8a)。最终的肿瘤重量与肿瘤尺寸测量一致，并且根除的肿瘤不包括在肿瘤重量图中(图8b)。血浆化合物浓度也证明了剂量依赖性(图8c)。
[0155]
化合物2.001和化合物2.003(各自以30mg/kg口服给药(每日两次))也导致与pd-l1抗体(德瓦鲁单抗)类似的肿瘤抑制(比较，图9a、图9b和图9c)。图9a绘制了当向小鼠施用化合物2.001时的肿瘤生长，图9b绘制了当向小鼠施用化合物2.003时的肿瘤生长，图9c绘制了当向小鼠施用抗pd-l1抗体(德瓦鲁单抗)时的肿瘤生长。每个图中的上小图是每个组中的10只小鼠的平均肿瘤尺寸，下图是个体动物的肿瘤进展。抗pd-l1治疗组中的6只动物，化合物2.001治疗组中的4只动物，和化合物2.001治疗组中的4只动物实现了完全消退。
[0156]
在上述模型中，在给药6天后，测量每个小鼠中的化合物2.001和化合物2.003(各自以30mg/kg口服给药，每日两次)的血浆浓度。血浆谷浓度绘制在图10中。
[0157]
为检查化合物2.001在肿瘤细胞上占据pd-l1的程度，我们使用另外的pd-l1检测抗体染色分离自这些肿瘤的细胞。一旦化合物2.001或治疗抗pd-l1(德瓦鲁单抗)结合pd-l1，则此检测抗体不与其结合。来自化合物2.001处理的肿瘤的细胞完全缺失通过此检测抗体染色的pd-l1，这证明了化合物2.001几乎完全占据pd-l1(图11)。
[0158]
针对肿瘤浸润免疫细胞，分析上述小鼠模型中的每个治疗条件。化合物2.001治疗增加了cd8
和cd4
t细胞两者，这与抗pd-l1治疗的肿瘤类似(图12)。
[0159]
本文描述了本发明的特定实施例，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了前述说明之后，所披露的实施例的变体对于本领域技术人员而言将变得显而易见，并且期望那些技术人员可以适当地采用这样的变体。因此，旨在以不同于本文特别描述的方式来实践本发明，并且本发明包括适用法律允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同形式。此外，除非本文另外指示或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变化中的任何组合。
[0160]
将本说明书中所引用的所有公开、专利申请、登录号和其他参考文献通过引用并
入本文，如同每个单独的公开或专利申请具体地且单独地指示通过引用并入。