1.本发明属于烟草农业技术领域，具体涉及荷叶提取物在降低烟草亚硝胺含量中的应用。
背景技术：
2.烟草特有亚硝胺(tsnas)是烟草特有的n-亚硝基类化合物，广泛存在于各类烟叶中。tsnas作为一类强烈的致肿瘤物质，与肺癌、食管癌、胃癌、肝癌等疾病的发生息息相关，严重威胁着人类健康，同时也限制了烟草行业的发展。
3.tsnas在成熟的烟叶片中含量低，其主要在烟叶调制过程中形成。在烟叶调制过程中，tsnas的合成前体物烟草生物碱和亚硝酸盐，经微生物及亚硝化作用而形成tsnas。因此常在烟草调制过程中，采用不同技术如微波、高温、生物菌剂等减少烟叶中生物碱的亚硝酸化，降低tsnas合成，减少卷烟对人体的危害。但发明人发现，这些处理方式是对烟叶表面或表层的微生物进行灭活或者需要特殊的环境实现菌种发酵，而烟叶需要长时间的保存，在保存期间，烟叶内部的微生物仍然会还是会继续将烟叶中硝酸盐还原成tsnas。
4.现有技术中发现利用植物天然提取物可降低烟草及其制品的危害。如在香烟的烟丝中加入野菊花组分可降低香烟焦油量和亚硝胺含量，从而及时地预防和缓解吸烟引起的咳嗽、气喘、瘀痰等各种不良反应。用钻叶琳和银杏叶提取物复配成的生物组合物制作复合滤嘴，明显降低烟气中的自由基、tsnas等有害成分的释放量。将甘草总黄酮、银杏叶提取物、淫羊霍总黄酮、黄蔑总昔、原花青素、麦冬总皂苷等植物提取物添加到烟草制品中可清除有害物质的自由基、多环芳烃和亚硝胺化合物，有效减少烟气对人体同危害。在烟叶采收调制前叶面喷施马齿苋提取物，可以显著降低烟叶及烟气中tsnas含量。如中国专利cn102349697a公开了一种含有植物提取物的烟草及其制备方法，所述植物提取物选自甘草总黄酮、银杏叶提取物、淫羊霍总黄酮、黄蔑总昔、原花青素、麦冬总皂苷中的一种或多种，然后取植物提取物滤液对烟草进行喷洒。这类技术符合当前无公害趋势，但上述部分植物材料在应用上还存在材料来源不够广泛、提取工艺复杂、应用成本较高、应用效果不够稳定等缺点。
5.莲为莲科莲属的多年生水生草本植物，属于国家卫计委公布的药食同源植物，在我国广泛种植，每年有千万亩的栽培面积。荷叶，是莲的叶部器官，富含多种具有抑菌、抗氧化能力和抗癌功效的生物碱和黄酮等多种功能化合物，可有效防止高血压、高血脂，降低心血管疾病、糖尿病、癌症所导致的死亡率。因此荷叶作为原料被用于保健品、功能食品和药品中。目前每年莲田所生产的荷叶只有部分被开发利用，大部分被搁置成垃圾或焚烧，造成原材料浪费和环境污染。目前还没有利用荷叶降低烟草亚硝胺含量的相关报道，此外，荷叶化学成分复杂，荷叶中降低烟草特有亚硝胺的功能成分尚未鉴定。
技术实现要素：
6.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供荷叶提取物在降低烟草亚硝胺含量中
的应用，并成功鉴定出荷叶提取物中降低烟草亚硝胺含量的功能成分为槲皮素-3-o-葡糖苷酸、金丝桃苷和异槲皮苷。
7.本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的。
8.荷叶提取物在降低烟草亚硝胺含量中的应用，所述荷叶提取物中降低烟草亚硝胺含量的功能成分包括槲皮素-3-o-葡糖苷酸、金丝桃苷、异槲皮苷中的至少一种。
9.优选的，所述荷叶提取物的制备方法如下：将新鲜荷叶用液氮研磨成粉末，然后按料液比1g:(2～3)ml将粉末浸于60％～80％甲醇中浸提12～24h，离心后取滤液，反复提取后合并滤液，减压浓缩后进行冷冻干燥，得到所述荷叶提取物。
10.优选的，应用方法如下：将所述荷叶提取物加水稀释成浓度为40～100mg/l的荷叶提取物工作液，在烟叶采收调制前1～7天，取所述荷叶提取物工作液在大田对烟株进行叶面喷施。
11.优选的，应用方法如下：将所述功能成分加水稀释成浓度为25～75mg/l的工作液，在烟叶采收调制前1～7天，取所述工作液在大田对烟株进行叶面喷施。
12.优选的，所述荷叶提取物中降低烟草亚硝胺含量的功能成分的分离方法包括以下步骤：
13.s1.荷叶提取物的制备：将鲜叶荷叶研磨成粉末，用甲醇溶液浸提后，经分离、干燥得到荷叶提取物；
14.s2.荷叶提取物中功能成分的鉴定：将步骤s1得到的荷叶提取物超声溶解于甲醇水溶液中，然后将溶液注入液相色谱仪-质谱仪中进行检测，采集出峰数据，得到荷叶提取物中的功能成分；
15.s3.荷叶提取物中功能成分的分离纯化：将步骤s1得到的荷叶提取物超声溶解于甲醇水溶液中，得到待分离样品溶液，然后将溶液注入反相高效液相色谱仪中进行检测，根据色谱峰时间进行功能成分的收集，完成功能成分的分离。
16.优选的，步骤s2中，色谱条件如下：色谱柱为waters sunfire c18；流动相a为0.5％甲酸水，流动相b为0.1％甲酸乙腈；流动相梯度为0-10min，12％ b；10-32min，12％-20％b；32-40min，20％-30％ b；40-48min，30％-60％ b；48-49min，60％-12％ b；49-53min，12％ b；流速为0.5～1.0ml/min，柱温为25～35℃。
17.优选的，步骤s3中，高效液相色谱的条件如下：色谱柱为phenomenex luna c18；流动相a为含0.1％三氟乙酸的超纯水，流动相b为0.1％乙腈；流动相梯度为0-5min，5％-5％b；5-35min，5％-25％ b；35-40min，25％-25％ b；40-45min，25％-30％ b；45-50min，30％ b；50-60min，100％ b；流速为70～90ml/min，柱温为25～35℃。
18.优选的，步骤s2中，色谱图中有8个特征峰：峰1为杨梅素-3-o-葡萄糖苷，峰2为槲皮素-3-o-吡喃阿拉伯糖苷，峰3为芦丁，峰4为金丝桃苷，峰5为异槲皮苷，峰6为槲皮素-3-o-葡糖苷酸，峰7为山奈酚-3-o-葡萄糖苷，峰8为异鼠李素-3-o-葡萄糖苷。
19.优选的，步骤s1的具体操作为，将新鲜荷叶用液氮研磨成粉末，然后按料液比1g:(2～3)ml将粉末浸于60％～80％甲醇中浸提12～24h，离心后取滤液，反复提取2次后合并滤液，减压浓缩后进行冷冻干燥，得到所述荷叶提取物。
20.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
21.(1)本发明的荷叶提取物降低烟草亚硝胺含量的效果显著，在大田施用荷叶提取
物能使烟叶中tsnas含量的降低幅度达到10％-60％，提高烟叶品质。
22.(2)本发明成功鉴定并分离出荷叶提取物中降低烟草亚硝胺含量的功能成分槲皮素-3-o-葡糖苷酸、金丝桃苷和异槲皮苷。
附图说明
23.图1为荷叶提取物的色谱图，其中图1a为纯化前的色谱图，图1b为纯化后的色谱图；
24.图2为荷叶提取物中功能成分的化学结构式。
具体实施方式
25.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例
27.本实施例提供一种荷叶提取物中降低烟草亚硝胺功能成分的分离方法，包括以下步骤：
28.s1.荷叶提取物的制备：采集新鲜荷叶去掉主叶脉，放入研钵中进行液氮研磨，得到粉末，然后按料液质量比1:2加入70％的甲醇提取液，浸提24h，提取液在10000g的离心力下离心10min，反复提取2次后合并滤液，使用郑州长城旋转蒸发仪在38℃下进行减压浓缩，最后进行冷冻干燥，得到棕黄色固体即为荷叶提取物；
29.s2.荷叶提取物中功能成分的鉴定：取0.1g荷叶提取物超声溶解于2ml 50％甲醇水溶液中，过0.22μm微孔滤膜后得到供试品溶液；将供试品溶液注入液相色谱仪-质谱仪中进行检测，采集荷叶提取物的出峰信息；其中，液相色谱所采用的条件如下：所用的色谱柱为waters sunfire c18(150
×
4.6mm，3.5μm)，流动相为含0.5％甲酸的超纯水(流动相a)和含0.1％甲酸的乙腈(流动相b)，流动相梯度为0-10min，12％ b；10-32min，12％-20％b；32-40min，20％-30％ b；40-48min，30％-60％ b；48-49min，60％-12％ b；49-53min，12％ b；进样体积为10μl，检测波长为350nm，流速为0.6ml/min，柱温为30℃；
30.得到的色谱图如图1a，共检测到8个主要的色谱峰，根据主成分峰的质谱碎片信息鉴定为：峰1为杨梅素-3-o-葡萄糖苷，峰2为槲皮素-3-o-吡喃阿拉伯糖苷，峰3为芦丁，峰4为金丝桃苷，峰5为异槲皮苷，峰6为槲皮素-3-o-葡糖苷酸，峰7为山奈酚-3-o-葡萄糖苷，峰8为异鼠李素-3-o-葡萄糖苷；这些化合物均为黄酮类化合物，其中槲皮素-3-o-葡糖苷酸、异槲皮苷和金丝桃苷含量最多，占黄酮化合物总量的85％；
31.s3.荷叶提取物中功能成分的分离纯化：取1.2g荷叶提取物超声溶解于20ml 50％的甲醇水溶液中，过0.45μm微孔滤膜后得到待分离样品溶液；采用反相pre-hplc进行样品分离，按照色谱峰时间收集各功能成分；高效液相色谱的条件如下：所用的色谱柱为phenomenex luna c18(300
×
50mm，10μm)，流动相为含0.1％三氟乙酸的超纯水(流动相a)和0.1％乙腈(流动相b)，流动相梯度0-5min，5％-5％ b；5-35min，5％-25％ b；35-40min，25％-25％ b；40-45min，25％-30％ b；45-50min，30％ b；50-60min，100％ b；检测波长220nm和350nm；流速为80ml/min，柱温为25℃；
32.采用起始流动相(5％的有机相)以80ml/min的流速平衡色谱柱约10min，进行柱平衡；然后用20ml注射器吸取待分离样品溶液，分3次手动进样，每次进样时间间隔10s；按照色谱峰的出峰顺序依次收集各馏分，hplc检测确定目标物馏分；参照附图1b，从色谱图中共检测到3个主要的色谱峰，经质谱仪鉴定，这3种物质分别为槲皮素-3-o-葡糖苷酸、金丝桃苷和异槲皮苷；3中功能成分的化学结构式见图2，其中a为槲皮素-3-o-葡糖苷酸，b为金丝桃苷，c为异槲皮苷；
33.s4.荷叶提取物清除dpph活性氧能力的测定：取250μl浓度为0.1mm的dpph乙醇溶液和50μl浓度为50mg/l的荷叶提取物(或功能成分)加入到96孔板中，混匀，室温避光放置30min后，用紫外可见分光光度计测定517nm处的吸光值ai；以加250μl浓度为0.1mm的dpph乙醇溶液和50μl超纯水为空白，其吸光度值记为a0；以加250μl乙醇和50μl荷叶提取物(或功能成分)为对照，其吸光度值记为aj。
34.计算荷叶提取物(或功能成分)样品对dpph的清除率，计算公式为：
35.清除率＝[1-(ai aj)/a0]
×
100％
[0036]
计算得到50mg/l荷叶提取物样品的清除率为85.8％，50mg/l槲皮素-3-o-葡糖苷酸、金丝桃苷和异槲皮苷的清除率为91.7％、80.5％和43.2％。表明荷叶提取物对dpph活性氧自由基有具很强的清除作用，荷叶提取物中的功能成分槲皮素-3-o-葡糖苷酸和金丝桃苷具有很高的清除能力，特别是槲皮素-3-o-葡糖苷酸具有最强的dpph活性氧自由基清除能力。
[0037]
应用例1
[0038]
将荷叶提取物(即总黄酮类化合物)加水稀释溶解，分别得到浓度为20mg/l(h1)、40mg/l(h2)、100mg/l(h3)和200mg/l(h4)的荷叶提取物工作液。在田间烟叶采收调制前1天，分别取1.6l荷叶提取物工作液h1、h2、h3和h4，在田中对20株白肋烟(品种为鄂烟1号)烟株进行叶面喷施，同时喷施等量清水作为对照。
[0039]
使用常规方法采收晾制后，随机取样，分别测定白肋烟上部烟叶和中部烟叶tsnas含量，结果见表1。
[0040]
表1白肋烟(品种为鄂烟1号)tsnas含量
[0041][0042]
由表1数据可知，本发明的荷叶提取物具有阻断白肋烟烟叶tsnas合成的功能成分。
[0043]
应用例2
[0044]
将荷叶提取物加水稀释溶解，分别得到浓度为20mg/l(h1)、40mg/l(h2)、100mg/l
(h3)和200mg/l(h4)的荷叶提取物工作液(制备方法同应用例1)。在田间烟叶采收调制前第7天，分别取1.6l荷叶提取物工作液h1、h2、h3和h4，在田中对20株雪茄烟(品种为楚雪14号)烟株进行叶面喷施，同时喷施等量清水作为对照。
[0045]
使用常规方法采收晾制后，随机取样，分别测定雪茄烟上部烟叶和中部烟叶tsnas含量，结果见表2。
[0046]
表2雪茄烟(品种为楚雪14号)tsnas含量
[0047][0048]
由表2数据可知，本发明的荷叶提取物具有阻断雪茄烟叶tsnas合成的功能成分。
[0049]
应用例3
[0050]
将荷叶提取物功能成分(即槲皮素-3-o-葡糖苷酸和金丝桃苷)加水稀释溶解，分别得到浓度为20mg/l、50mg/l和75mg/l的槲皮素-3-o-葡糖苷酸(q1、q2和q3)和金丝桃苷(t1、t2和t3)工作液。在田间烟叶采收调制前3天，分别取1.0l工作液，在田中对10株白肋烟(品种为鄂烟1号)烟株进行叶面喷施，同时喷施等量清水作为对照。
[0051]
使用常规方法采收晾制后，随机取样，分别测定白肋烟上部烟叶和中部烟叶tsnas含量，结果见表3。
[0052]
表3白肋烟(品种为鄂烟1号)tsnas含量
[0053]
由表3数据可知，本发明的荷叶提取物功能成分具有阻断烟草特有亚硝胺合成的功能，其中槲皮素-3-o-葡糖苷酸的效果更强。
[0054]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。