1.本发明涉及生物
技术领域：
：中，辣椒细胞核雄性不育分子标记及其应用。
背景技术：
：：2.辣椒是茄科(solanaceae)辣椒属(capsicum)一年生或多年生草本植物。广泛栽培于全球各地，是一种世界范围内具有重要经济价值的蔬菜作物，也是人们饮食生活中非常重要的一种调味品。3.辣椒上同时存在细胞核不育型(gms)和细胞质不育型(cms)。cms育性由细胞质和细胞核基因共同控制，可以育成100％不育的雄性不育系，杂种种子生产时利用较方便，但父本恢复基因较少，且雄性不育常不稳定，影响杂种纯度。gms育性仅受细胞核基因控制，普通的自交系均能使杂种育性全部恢复，育种中父本来源广泛，且不育性稳定，生产种子时易于保证杂种纯度，因此gms更便于利用，应用前景广阔。4.目前为止，国内外学者已发现大约20个辣椒细胞核雄性不育基因，其中国内学者发现并利用的不育基因为msc-1和msc-2(wangandbosland,2006)，但这些基因之间的关系大部分还不清楚。目前国内外研究者对7个ms基因进行了定位或开发了连锁标记(表1)，其中ms10和ms3被定位在1号染色体上，但其等位性未知，ms8被定位在4号染色体上，且这三个基因到目前为止还未克隆出来。ms1和msc-2定位到5号染色体上，序列分析表明它们是同一个基因，均编码一个phd-finger的转录因子，与拟南芥atms1同源；msw也被定位到5号染色体上，其与ms1和msc-2等位性未知；msc-1被定位到2号染色体上，编码一个bhlh的转录因子，与拟南芥atdyt1同源。5.前期学者克隆到的辣椒细胞核雄性不育基因msc-1和msc-2都是在灯笼形辣椒中发现的自然突变体，它们在灯笼形辣椒中便于转育和利用，而在羊角形和牛角形辣椒中较难转育和利用，因此开发辣椒雄性不育分子标记，有利于培育更多的辣椒新品种。6.表1辣椒gms中已被定位或开发连锁标记的ms基因[0007][0008]技术实现要素：[0009]本发明所要解决的技术问题是如何检测辣椒雄性育性。[0010]为解决上述技术问题，本发明首先提供了辣椒雄性不育分子标记或检测所述辣椒雄性不育分子标记的物质在检测或辅助检测辣椒雄性育性中的应用；[0011]所述辣椒雄性不育分子标记为辣椒基因组中对应于序列表中序列3的dna片段，辣椒基因组中含有或不含有序列表中序列3的dna片段。[0012]上述应用中，所述检测所述辣椒雄性不育分子标记的物质可包括(或可为)：能扩增含有序列表中序列3的dna片段的引物对，或能扩增序列表中序列3所示dna片段或其部分片段的引物对，或能特异识别序列表中序列3所示dna片段的引物和/或探针。[0013]上述应用中，所述引物对可由序列表中序列1和2所示的两条单链dna组成。[0014]本发明还提供了检测辣椒雄性育性的方法，所述方法包括：检测待测辣椒的基因组dna中是否含有序列3所示的dna片段，含有序列3所示的dna片段的待测辣椒为或候选为雄性可育辣椒，不含有序列3所示的dna片段的待测辣椒为或候选为雄性不育辣椒。[0015]本发明还提供了检测辣椒雄性育性的方法，所述方法包括：以待测辣椒的基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；检测所述pcr产物的序列，含有序列3所示的dna片段的待测辣椒为或候选为雄性可育辣椒，不含有序列3所示的dna片段的待测辣椒为或候选为雄性不育辣椒。[0016]本发明还提供了检测辣椒雄性育性的方法，所述方法包括：以待测辣椒的基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；检测所述pcr产物的大小，含有大小为212bp的dna片段的待测辣椒为或候选为雄性可育辣椒，不含有大小为212bp片段的待测辣椒为或候选为雄性不育辣椒。[0017]上述方法中，利用所述引物对进行pcr扩增的体系可为：基因组dna2μl、mix(康为世纪，cw0682)5μl、正向引物和反向引物各0.5μl(10μm/l)、12μl灭菌水。[0018]上述方法中，利用所述引物对进行pcr扩增的条件可为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸5min。[0019]所述检测所述辣椒雄性不育分子标记的物质，也属于本发明的保护范围。[0020]所述检测所述辣椒雄性不育分子标记的物质在制备检测或辅助检测辣椒雄性育性产品中的应用，也属于本发明的保护范围。[0021]所述辣椒雄性不育分子标记或所述检测所述辣椒雄性不育分子标记的物质在辣椒育种中的应用，也属于本发明的保护范围。[0022]本发明中，辣椒雄性不育可为辣椒细胞核雄性不育。[0023]实验证明，在554株的辣椒20q5066ab群体中，可育株共有281株，田间育性鉴定均表现为可育，p-04-575f与p-04-575r的扩增产物均含有序列表中序列3所示的dna片段；不育株共有273株，田间育性鉴定均表现为雄性不育，p-04-575f与p-04-575r的扩增产物均不含有序列表中序列3所示的dna片段。表明，本发明辣椒雄性不育分子标记可用于鉴定辣椒雄性不育，适用性极强，育种实际应用中可以利用该标记进行育性快速鉴定。附图说明[0024]图1为可育池和不育池的pcr扩增产物检测结果。a-pool：不育池；b-pool：可育池。[0025]图2为利用分子标记p-04-575对48份辣椒材料的鉴定结果。[0026]图3为田间育性鉴定结果。具体实施方式[0027]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
：普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。[0028]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。[0029]实施例1、p-04-575为与辣椒雄性不育有关的分子标记[0030]1.定位群体的构建[0031]本实施例以辣椒细胞核雄性不育两用系群体20q5066ab为试验材料，该群体构建方法如下：(1)以‘bruinsmawonder’自交得到的f2中出现的不育株做母本，自交系17c609为父本做杂交得到f1，自交得到f2代，然后以该f2代分离出来的不育株做母本，以17c609为父本连续回交6代得到bc6f2代；(2)在bc6f2代进行10对兄妹交(即以群体里的雄性不育株作母本，雄性可育株作父本)，后代全部为可育的全部去掉，后代出现育性始终保持1：1的分离比，且群体主要农艺性状基本稳定，即育成了新的雄性不育两用系20q5066ab。20q5066ab群体大小为554株。[0032]‘bruinsmawonder’记载文献：王得元，杨凤梅，李颖，王恒明.辣椒核雄性不育基因研究进展.中国蔬菜，2008(9):40-43。[0033]自交系17c609：记载于以下文献的附表tables2：wul,wangp,wangy,chengq,luq,liuj,lit,aiy,yangw,sunl,shenh.genome-widecorrelationof36agronomictraitsinthe287pepper(capsicum)accessionsobtainedfromtheslaf-seq-basedgwas.intjmolsci.2019nov13；20(22):5675.。[0034]2.分子标记p-04-575的获得[0035]利用20q5066ab可育池和不育池对开发的ssr和indel标记进行多态性筛选。经过筛选，发现分子标记p-04-575在可育池和不育池间具有稳定的多态性，如图1所示，利用p-04-575f与p-04-575r组成的引物对分别对可育池和不育池的基因组dna进行pcr扩增，可育池的扩增产物含有大小为212bp的片段(其序列为序列表中序列3)，不育池的扩增产物不含该212bp的片段。引物序列如下所示：[0036]p-04-575f：5’‑gaagaggactttccccaactcat-3’(序列表中序列1)；[0037]p-04-575r：5’‑ttccgatgtttaattgtcagaaaa-3’(序列表中序列2)。[0038]扩增产物序列：gaagaggactttccccaactcatggcccagaccttaactgggcgtggataccatggcttatgagaaggaggattgcccaagccttataaggagaccaaagaccctttcctctttaagatatttaacaataactatgaaagaaaattgacatccacacaaaagtgagtgaagtcatgttttagaaaatattttctgacaattaaacatcggaa(序列表中序列3)。[0039]pcr反应体系(20μl)为：基因组dna2μl、mix(康为世纪，cw0682)5μl、正向引物和反向引物各0.5μl(10μm/l)、12μl灭菌水。[0040]pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸5min。[0041]扩增产物用1.5％的琼脂糖进行检测，电压120v，电泳时间为25分钟。[0042]在554株的20q5066ab群体中，可育株共有281株，田间育性鉴定均表现为可育(图3中b)，p-04-575f与p-04-575r的扩增产物均含有序列表中序列3所示的dna片段；不育株共有273株，田间育性鉴定均表现为雄性不育(图3中a)，p-04-575f与p-04-575r的扩增产物均不含有序列表中序列3所示的dna片段。[0043]3.遗传连锁分析[0044]利用筛选所得的多态性分子标记p-04-575分析两用系群体的554个单株的基因型，并结合群体单株的田间育性鉴定结果，利用joinmap4.0软件绘制辣椒细胞核不育基因的遗传连锁图谱，结果表明：分子标记p-04-575与不育基因共分离。[0045]实施例2、分子标记p-04-575的应用[0046]1.试验材料[0047]本实施例利用48份已知基因型(msms)的辣椒自交系和品种(表2)，对分子标记p-04-575进行验证。所用自交系和品种均表现为雄性可育，可从中国农业大学园艺学院获得。[0048]表248份辣椒自交系和品种[0049][0050][0051]2.试验方法[0052]利用p-04-575f与p-04-575r组成的引物对分别对上述供试材料进行的基因组dna进行检测，pcr扩增体系与程序同实施例1。[0053]3.试验结果[0054]结果见表2，其中，aa表示p-04-575f与p-04-575r的扩增产物均含有序列表中序列3所示的dna片段。利用分子标记p-04-575对48份已知基因型(msms)的辣椒自交系和品种(表2)进行基因型检测(图2)。结果显示，p-04-575的结果与其已知基因型与表型的一致性为100％，表明这个标记的适用性极强，育种实际应用中可以利用该标记进行育性快速鉴定。[0055]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。当前第1页12当前第1页12