银杏内酯k在制备治疗
α-突触核蛋白病的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及银杏内酯k在制备治疗α-突触核蛋白病的应用。
背景技术：
2.α-突触核蛋白病(α-synucleinopathies)是一类神经退行性疾病，其主要特征是大量α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)在神经元和神经胶质细胞中异常聚集，形成纤维样的淀粉样斑块，导致神经元死亡和神经功能障碍。帕金森病(parkinson’s disease,pd)是其中最常见的一种，也是临床最常见的神经退行性疾病之一。据统计数据显示，2016年全球已有约600万pd患者，而随着老龄化进程的不断加速，pd的发生率和患病率也在逐年攀升，给社会和经济带来巨大的负担。
3.pd患者的临床表现以进行性加重的运动障碍为主，包括震颤、肢体僵硬、动作迟缓、姿势不稳等，以及多种非运动症状。临床现行的主要治疗手段包括药物治疗、脑深部电刺激(deep brain stimulation,dbs)等，能在一定程度上控制症状，但无法延缓或阻断疾病进程。针对帕金森病的疾病修饰疗法，亟待进一步探索。
4.靶向alpha-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)，是极具潜力的疾病修饰性治疗研究开发方向。目前研究认为，α-syn在pd的发生发展中起着至关重要的作用。1997年goedert团队发现，α-syn是构成路易小体(lewybody)的主要成分，而路易小体的沉积和黑质脑区多巴胺能神经元的丧失是pd的标志性病理改变。后续研究逐渐证实，α-syn的毒性作用是pd的核心致病机制。α-syn异常聚集成不溶性的病理性蛋白，可以直接影响神经元的正常结构和生理功能，引起多巴胺能神经元死亡。
5.尽管免疫疗法对α-突触核蛋白病显示出一定的效果，但这种方法的效率通常受到免疫反应差异的影响，且在长期使用过程中可能导致免疫相关的副作用。现有的小分子药物虽然可以对α-syn的构象进行调节，但由于α-syn的内在特性，很难通过常规技术进行筛选，且针对α-syn的分子往往缺乏特异性。大部分现有的技术主要聚焦于阻止α-syn的聚集，但是在疾病已经发展到一定阶段后，这种治疗策略的效果并不理想。
6.银杏内酯k(ginkgolide k，gk，c20h22o9)是银杏叶中的一种活性成分，是银杏内酯b(ginkgolide b,gb，c20h24o10)的衍生物。在一系列的研究中，gk已被证明具有显著的神经保护效果。比如，gk被发现可以保护鼠嗜铬细胞癌细胞(pc12)克隆系列中的细胞免受谷氨酸诱导的细胞毒性(ma et al.2012a)。此外，gk通过激活肌醇所需酶1a/x盒结合蛋白-1(ire1α/xbp1)途径，对内质网应激造成的心脏损伤也表现出保护作用。然而，未发现利用gk治疗α-突触核蛋白病的研究与报道。
技术实现要素：
7.有鉴于此，本发明提供了银杏内酯k在制备α-突触核蛋白病的应用。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.银杏内酯k在制备治疗α-突触核蛋白病的药物中的应用。
10.本发明中，所述α-突触核蛋白病包括帕金森病、多系统萎缩、路易体痴呆等。
11.本发明中，所述治疗包括降低脑内α-syn水平，对于帕金森病、多系统萎缩、路易体痴呆等疾病起到神经保护作用。
12.本发明还提供了银杏内酯k在制备降低神经元细胞α-syn水平的药物中的应用。
13.本发明还提供了银杏内酯k在制备降低颅脑内α-syn水平的药物中的应用。
14.本发明上述应用中，银杏内酯k的给药方式包括口服、静脉注射、颅内注射(脑实质内、脑室内)、皮下注射中任意一种。一些具体实施例中，所述给药方式为腹腔注射。
15.本发明中，所述腹腔注射给药的每日剂量为0.5mg/kg～20mg/kg体重，一些具体实施方案中具体可为20mg/kg体重。本领域技术人员可根据病情或实际需求增加或减少给药频次、增减单次给药剂量等，达到本发明类似治疗效果的给药方式均可。
16.本发明所述应用中，所述药物还包括药学上可接受的载体。给药前，先将银杏内酯k溶于载体中，如peg400、水、葡萄糖溶液或ph 2-9的缓冲溶液。
17.本发明还提供了一种治疗α-突触核蛋白病的药物，其包括银杏内酯k。
18.本发明还提供了一种α-突触核蛋白病的治疗方法，包括：给予银杏内酯k或含有银杏内酯k的药物。
19.本发明中，所述银杏内酯k在治疗α-突触核蛋白病中的用量为20mg/kg/day。
20.本发明模拟α-突触核蛋白病的多种模型，包括过表达α-突触核蛋白的细胞模型、体外预合成的α-突触核蛋白纤维诱导的细胞模型，以及过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠b6；c3-tg(prnp-snca*a53t)83vle/j。结果显示银杏内酯k处理后，各种模型中的α-突触核蛋白病病理程度降低，银杏内酯k可以明显改善α-突触核蛋白病病理程度，为银杏内酯k在α-突触核蛋白病中的应用提供了临床前证据。
附图说明
21.图1示gk在不同的细胞模型中降低α-syn水平；a：体外预合成的α-syn纤维(pre-formedfibrils，pffs)处理神经元的电泳结果；b慢病毒感染以过表达a53t位点突变的α-syn的原代神经元的电泳结果；c：表达a53t位点突变的α-syn纯合子转基因小鼠原代神经元细胞模型的免疫荧光结果；
22.图2示gk降低a53tα-syn纯合子转基因小鼠脑内α-syn含量；a：westernblots结果；b：免疫组化结果。
具体实施方式
23.本发明提供了银杏内酯k在制备alpha-突触核蛋白病的药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
24.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
25.本发明中，银杏内酯k(ginkgolide k，gk)通过市购获得，银杏内酯k属于银杏叶提
取物中的一种活性成分，为白色至类白色的粉末。其化学名为(1r,2s,3r,4r,6r,7s,8s,10s,11s,14r,15s,16r,17r)-2,3,7,8,11,12,16,17-八羟基-10,15-二氧代-1,6-二氮杂-4,9,13,18-四环五十烷-5,20-二酮，化学式为c20h22o9，分子量为406.13g/mol。
26.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
27.实施例1
28.(一)细胞模型构建和药物处理
29.1.snca
a53t
过表达的原代神经元模型：
30.利用慢病毒载体构建α-syn基因a53t突变体：首先，通过向α-syn基因引入点突变，生成a53t突变体。然后，将这个突变体插入慢病毒表达载体中。制备重组慢病毒：将构建好的载体与包装载体共转入293t细胞，然后收集含有病毒颗粒的细胞上清液。将含有a53t突变体的重组慢病毒上清液加入到培养的原代神经元中。病毒将通过感染的方式进入细胞，将其基因组插入到细胞的dna中。
31.2.体外预合成的α-突触核蛋白纤维诱导建立细胞模型：
32.培养过程中，细胞置于湿度环境下，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃的细胞孵化器中。当细胞覆盖率达到70-80％时，向不同的细胞培养物中加入gk(gk：培养基的比例＝1:1000)，最终浓度为30μg/ml。所有的细胞培养物继续在细胞孵化器中培养24小时。对照组细胞培养物中添加相同体积的dmso。利用蛋白电泳检测α-syn蛋白水平结果见图1a～1b(blank为添加dmso的对照)，并进行免疫荧光分析，结果见图1c。
33.(二)动物组织处理及取材：
34.f1代b6；c3-tg(prnp-snca*a53t)83vle/j小鼠及其同窝对照小鼠购自the jackson laboratory。通过qpcr基因鉴定获得表达snca的纯合子小鼠作为gk给药的实验组小鼠。小鼠饲养在恒温(22℃到25℃)、恒湿(相对湿度55％-60％)、全自动光控(早7到晚7白天/黑夜循环)、食物及水充足的清洁级动物房内。本实验涉及操作经复旦大学伦理委员会批准。gk组小鼠每天固定时间腹腔注射gk，20mg/kg体重，对照组(ctrl)注射等量载体溶剂peg400。
35.注射两个月后，使用腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉动物，经心脏快速灌注预冷的pbs，断头后取出脑组织，左半脑在4％多聚甲醛中固定24h后，换20％和30％蔗糖溶液梯度沉糖各24h。沉糖脱水结束后使用oct包埋，速冻后进行连续冰冻切片，切片厚度为20μm，将脑片置于脑片保护液中，-20℃保存(脑片保护液：使用50ml 0.1m pbs溶解30g蔗糖，加入30ml乙二醇，再用0.1m pbs定容至100ml)。右半球按脑区解剖，液氮中快速冷冻后在-80℃下储存直至使用。
36.利用免疫组化和蛋白电泳检测α-syn蛋白水平，结果见图2。
37.(三)结果分析
38.由图1可知，gk在不同的细胞模型中均可降低α-syn水平。
39.由图2可知，gk可以降低a53tα-syn纯合子转基因小鼠脑内的α-syn含量；同时a53tα-syn纯合子转基因小鼠脑内病理性α-syn含量明显降低。
40.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。