桃叶珊瑚苷在制备治疗缺血性脑病的药物中的用途
发明领域：
1.本技术属于脑卒中治疗领域和天然药物领域，具体地，本技术提供了桃叶珊瑚苷在制备治疗缺血性脑病的药物中的用途。
背景技术：
2.脑卒中具有患病率高、致残率高、死亡率高及复发率高等特点，全国每年新发脑卒中患者约为200万人，其中75％-85％为缺血性脑卒中(ischemic stroke，is)。缺血性脑卒中又称脑梗死，是指由于脑组织局部的血液供应障碍，缺血、缺氧所导致的局限性的脑组织软化或坏死。有大量研究表明中国是全世界缺性脑卒中发病最高的国家之一，且卒中的复发率高于全球平均水平。随着缺血性脑卒中的患病人群庞大，该疾病已成为中国巨大的医疗和经济负担。缺血性脑卒中的发病机制发杂，就目前而言，静脉溶栓是迄今为止最为有效的干预措施之一，也被世界上许多国家和地区采用。但是由于其治疗窗狭窄、且有出现血性转化的风险以及存在永久性神经功能损伤，故目前只有少数患者受益。因此及早恢复脑部血液的供应、促进损伤后的修复、减少损伤后遗症，寻找安全有效的神经保护剂一直是脑科学和神经医学领域研究的热点，同时也具有重要的社会价值和研究意义。
3.桃叶珊瑚苷(aucubin)，是一种环烯醚萜类化合物。桃叶珊瑚苷主要从杜仲、车前草、地黄等植物中提取出来，大量文献均证实其具有抗氧化、抗光老化和促进胶原合成的功效，是一种潜在的纯天然防衰老保护剂。已有文献报道，桃叶珊瑚苷对创伤性脑损伤有一定的保护作用，研究人员通过构建体外神经元氧化应激模型和体内tbi模型，发现在体外神经元氧化应激模型中，桃叶珊瑚苷能通过nrf2-are通路发挥抗氧化和抑制神经元凋亡等作用；同时，在tbi模型中桃叶珊瑚苷同样能够促进神经元内nrf2入核，激活nrf2-are抗氧化通路，抑制氧化应激反应，减轻炎症反应，减少神经元丢失，缓急脑水肿并改善小鼠的运动和认知功能从而发挥神经保护作用。此外还有研究指出桃叶珊瑚苷对出血性脑损伤、蛛网膜下腔出血、糖尿病脑病等疾病具有一定的保护作用。但是，桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤是否具有保护作用暂无报道。因此将其发展为治疗缺血性脑损伤的药物具有极高的价值和社会意义。
技术实现要素：
4.本发明的目的是通过对桃叶珊瑚苷的药理作用研究，提供桃叶珊瑚苷在制备治疗缺血性脑损伤药物中的用途。
5.一方面，本技术提供了桃叶珊瑚苷在制备治疗缺血性脑损伤药物中的用途。
6.另一方面，本技术提供了桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂在制备治疗缺血性脑损伤药物中的用途。
7.进一步地，所述trpm2抑制剂为aca。
8.进一步地，所述缺血性脑损伤为急性脑缺血再灌注损伤。
9.进一步地，所述桃叶珊瑚苷单次应用剂量仅限于不引起中枢抑制的剂量。
10.进一步地，所述桃叶珊瑚苷单次应用剂量为20-80mg/kg；优选40-80mg/kg；更优选80mg/kg。
11.进一步地，所述桃叶珊瑚苷和aca的单次应用剂量为5-50mg/kg和1-40mg/kg；优选1-20mg/kg和2-10mg/kg；更优选15mg/kg和5mg/kg。
12.进一步地，所述药物为口服或注射剂型。
13.进一步地，所述药物为注射剂型。
14.进一步地，所述治疗缺血性脑损伤包括提高小鼠缺血性脑损伤后缺血侧的血流量，减少脑梗死体积，抑制缺血后脑组织神经元坏死程度。
15.进一步地，所述治疗缺血性脑损伤包括降低小鼠缺血性脑损伤后神经功能缺损评分，提高小鼠缺血性脑损伤后的认知和运动功能。
16.进一步地，所述治疗缺血性脑损伤包括改善线粒体功能障碍。
17.进一步地，桃叶珊瑚苷增加氧糖剥夺再灌注损伤后细胞的存活率。
18.进一步地，桃叶珊瑚苷降低氧糖剥夺再灌注损伤后细胞内ca
2
浓度。
19.进一步地，桃叶珊瑚苷减弱氧糖剥夺再灌注损伤后细胞的凋亡程度。
20.本技术中所述的桃叶珊瑚苷的结构式如(1)所示，其又名β-d-吡喃葡萄糖苷，英文名aucubin，简写为au，cas号为479-98-1，这些名称和编号可以交换使用。
[0021][0022]
本技术中所述的aca结构式如式(2)所示、又名n-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸，英文名n-(p-amylcinnamoyl)anthranilic acid，cas号为110683-10-8，这些名称和编号可以交换使用。
[0023][0024]
本技术的药物可用于治疗包括人在内的各种哺乳动物，除人之外的其他哺乳动物包括但不限于鼠、兔、犬等。
[0025]
本技术中可用的药物剂型包括注射和口服剂型，具体剂型包括但不限于片剂、胶
囊剂、口服液、针剂、粉针剂、透皮给药制剂，特别优选注射剂。
[0026]
除桃叶珊瑚苷外，本技术中所述的药物还可以包括药学上可接受的各种辅料、赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、稳定剂、粘合剂、抗氧化剂、ph调节剂、矫味剂等，特别是优选于注射剂的各种辅料。
[0027]
本发明的药物中可以包含治疗缺血性脑损伤的中西药或保健品，或者本发明的药物可以与这些中西药或保健品或治疗手段联合使用。所述中西药或保健品包括但不限于抗感染药物、促性腺激素药物、抗氧化剂类药物、能量代谢和血液循环改善药物以及天然提取物。
[0028]
有益效果：
[0029]
本发明首次证实，桃叶珊瑚苷具有治疗缺血性脑损伤所致神经元损伤的作用，可用于制备缺血性脑损伤的治疗药物。桃叶珊瑚苷以及桃叶珊瑚苷和aca的组合能显著降低小鼠缺血性脑损伤后神经功能评分；显著提高小鼠缺血性脑损伤后缺血侧的血流量；显著减少脑梗死体积；显著提高小鼠缺血性脑损伤后的认知和运动功能；桃叶珊瑚苷能减弱脑缺血引起的损伤程度，显著改善缺血后脑组织神经元坏死程度；显著增加氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞的存活率、降低细胞内ca
2
荧光强度、抑制细胞凋亡。
附图说明
[0030]
图1a、1b为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死体积的影响图1a、1b为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死体积的影响注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r组比较，
***
p《0.001。
[0031]
图2a、图2b、图2c为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠缺血侧大脑皮层血流灌注量的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.01。
[0032]
图3为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能评分的影响图3为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能评分的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
*
p《0.05。
[0033]
图4为morris水迷宫-定位航行实验观察桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠逃避潜伏期的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.001。
[0034]
图5为空间探索实验观察桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠穿越平台次数的影响与sham ns组比较，
#
p《0.05；与mcao/r ns组比较，
**
p《0.01。
[0035]
图6为morris水迷宫-空间探索实验各组小鼠目标象限比与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
**
p《0.01，
***
p《0.001。
[0036]
图7为morris水迷宫-空间探索实验小鼠运动轨迹
[0037]
图8为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠缺血侧海马ca3区域病理变化的影响(200
×
)-he染色。
[0038]
图9为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠缺血侧海马ca1区域病理变化的影响(100
×
)-he染色。
[0039]
图10为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠缺血侧海马ca3区域病理变化的影响(200
×
)-nissl染色。
[0040]
图11为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠缺血侧海马ca1区域病理变化的影响(100
×
)-nissl染色。
[0041]
图12为桃叶珊瑚苷对脑缺血再灌注损伤小鼠缺血侧脑组织海马神经元中线粒体超微结构的影响透射电镜。
[0042]
图13为桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂aca对缺血性脑损伤小鼠的神经功能缺陷评分的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
**
p《0.01。
[0043]
图14为桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂aca对缺血性脑损伤小鼠的脑梗死体积的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
*
p《0.05。
[0044]
图15为桃叶珊瑚苷和trpm2激动剂h2o2对缺血性脑损伤小鼠神经功能缺陷评分的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
*
p《0.05，与mcao/r au(80mg/kg)组比较，
p《0.05。
[0045]
图16桃叶珊瑚苷和trpm2激动剂h2o2对缺血性脑损伤小鼠脑梗死体积的影响与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.001，与mcao/r au组比较，
p《0.05。
[0046]
图17为桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞存活率的影响图17为桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞存活率的影响与control组比较，
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p《0.001；与ogd/r组比较，
***
p《0.001。
[0047]
图18a、18b为桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞内ca
2
的影响与control组比较，
###
p《0.001；与ogd/r组
***
p《0.001。
[0048]
图19a、19b为桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞凋亡的影响与control组比较，
###
p《0.001；与ogd/r组比较
***
p《0.001。
具体实施方式
[0049]
下面结合具体实施例详述本发明，但本发明的保护范围不局限于以下实施例。
[0050]
实施例1动物实验方案
[0051]
实验动物：
[0052]
体重为26-32g之间的spf级雄性成年小鼠，宁夏医科大学实验动物中心繁殖(动物孵育合格批号：scxk(宁)2020-0001)。动物饲养参照实验动物饲养标准，饲养房12h人工控制昼夜交替，小鼠自由饮水。
[0053]
实验药品及仪器：
[0054]
本实验中涉及到的主要药品和试剂包括：桃叶珊瑚苷(购买自上海源叶生物有限公司，纯度≥98％)；尼莫地平(购自德国拜耳公司)；生理盐水(购自天津大茂化学试剂厂)；模型线栓(购自瑞沃德公司)；ttc(购自sigma公司)；he试剂盒(购自武汉塞维尔生物科技有限公司)、nissl染色试剂盒(购自武汉塞维尔生物科技有限公司)；
[0055]
本实验中涉及到的主要仪器包括：激光散斑血流成像系统(瑞典帕瑞公司)；全波
长酶标仪(购自湖南赛默飞世尔科技有限公司)；电热恒温水浴锅(购自上海精密实验设备有限公司)；高速低温离心机(德国endorphin)。
[0056]
实验动物分组及给药：
[0057]
体重26-32g之间的雄性icr小鼠清洁级饲养性喂养一周，按体重梯度抽样法将其平均分至假手术组、模型组、模型组 桃叶珊瑚苷(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)组、模型组 尼莫地平1.4mg/kg组，每组6只。桃叶珊瑚苷组各给药组和尼莫地平组于每天上午固定时间点连续给药1周，假手术组和模型组在相同的时间点给予同体积的生理盐水，其余相同。
[0058]
实施例2各项动物实验过程和结果
[0059]
观察桃叶珊瑚苷对对缺血性脑损伤小鼠的神经保护作用
[0060]
实验分组及给药：
[0061]
将雄性icr小鼠随机分为以下7组：sham ns组、sham au(80mg/kg)组、mcao/r ns组、mcao/r au(20、40、80mg/kg)组、mcao/r nim(1.4mg/kg)组。mcao/r au(20、40、80mg/kg)组及mcao/r nim组于每天同一时间点腹腔注射给药，连续给药7天；其余各组在相同时间点给予相同体积的生理盐水，给药时间间隔均为24h/次。
[0062]
(一)桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠脑梗死体积的影响
[0063]
实验方法：
[0064]
在各组小鼠造模后24h取材，采用水合氯醛麻醉小鼠，迅速断头取出脑组织，并用生理盐水冲洗表面的杂质，转入预冷的脑槽中，放入-80℃冰箱中速冻3-5min,将小鼠大脑冠状切片称2mm的脑片5片，并加入2％ttc染色液，37℃孵育10min左右，可见正常脑组织为红色，梗死侧组织为白色。回收ttc染色液。加入适量4％甲醛溶液与4℃过夜，之后按脑片顺序摆放在含有刻度的水平板上拍照。并采用image-proplus软件检测小鼠缺血侧梗死体积。
[0065]
实验结果：
[0066]
结果如表1和图1a、图1b所示。与sham ns组相比，mcao/r ns组小鼠的脑梗死体积显著增加(p《0.001)；与mcao/r ns组相比，mcao/r nim组的脑梗死体积显著下降(p《0.001)，mcao/r au干预组小鼠的脑梗死体积显著下降(p《0.001)。
[0067]
表1桃叶珊瑚苷对小鼠缺血性脑损伤脑组织梗死体积的影响
[0068][0069]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.001
[0070]
(二)桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠大脑皮层血流灌注量的影响
[0071]
实验方法：
[0072]
在缺血24h后，麻醉小鼠，剔除小鼠颅脑顶骨部皮肤表面鼠毛，消毒后纵向切开皮肤，完全暴露骨膜表面，并在骨膜上滴加少量生理盐水，将激光散斑血流成像仪扫描器调至小鼠脑正上方处标记，检测大脑皮层脑血流变化，记录并导出数据进行分析。
[0073]
实验结果
[0074]
如表2和图2a、图2b、图2c所示，在脑缺血再灌注24h后，激光散斑血流血流成像结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠缺血侧大脑皮层脑血流量显著降低(p《0.001)；与模型组比较，在给予桃叶珊瑚苷治疗后，该组小鼠缺血侧的大脑皮层血流量显著上升(p《0.05，p《0.01，p《0.001)。
[0075]
表2桃叶珊瑚苷对小鼠缺血侧大脑皮层血流灌注量的影响
[0076][0077]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.01
[0078]
(三)桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠神经功能的影响
[0079]
实验方法：
[0080]
最后一次给药后并记录各组小鼠体重，采用双盲法进行实验。各组小鼠于给药后1h后造模，采用longa评分进行神经功能评分。
[0081]
参照zea-longa线栓法构建小鼠mcao/r模型。第7天给药1h后，腹腔注射4％水合氯醛麻醉小鼠，将小鼠呈仰卧位固定在操作台面，剪去颈部皮毛，碘伏消毒，沿着颈部正中间切开皮肤，钝性分离肌肉以及左侧颈总动脉(common carotid artery,cca)、颈外动脉(external carotid artery,eca)、颈内动脉(internal carotid artery,ica)；用动脉夹暂时夹闭cca，结扎eca远端，并在cca打一活结，将线栓插入至ica内约8mm-10mm左右遇阻力时停止，将线栓固定后缝合小鼠伤口，将小鼠放置在37℃保温毯上以维持小鼠体温。1.5h后拔除线栓，待小鼠完全清醒后于常规饲养环境下饲养。假手术组及假手术 桃叶珊瑚苷(80mg/kg)组小鼠仅暴露颈总动脉，不进行结扎操作，其余操作同mcao/r。实验结果：
[0082]
结果如表3和图3所示，模型组与假手术组相比，其神经功能评分显著上升(p《0.001)；给予桃叶珊瑚苷(20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg)治疗的小鼠神经功能评分显著下降(p《0.05，p《0.01，p《0.001)。尼莫地平治疗组也显著降低了小鼠神经功能评分(p《0.001)。提示桃叶珊瑚苷对小鼠缺血性脑损伤具有一定的保护作用。
[0083]
表3桃叶珊瑚苷对小鼠缺血性脑损伤神经功能评分的影响
[0084][0085]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
*
p《0.05(四)
[0086]
桃叶珊瑚苷对小鼠缺血性脑损伤后认知和运动功能的影响
[0087]
实验方法：
[0088]
学习记忆能力-morris水迷宫实验定位航行实验：模型制作的第二天开始，假手术组、模型组、和桃叶珊瑚苷组以及尼莫地平组小鼠进行水迷宫实验，共5次，5天内完成。正式实验前，将实验动物放入水池中，适应60s。训练过程中站台位置保持不变，依次从四个入水点将动物放进水中游泳。正式实验时，随机取一入水点，将动物面朝池壁放入池中，记录小鼠爬上平台的时间(即逃避潜伏期，escape lateney)。在前几次训练中，若60s内找不到站台，则用细棒牵引其爬上站台停留10s，此时escape lateney记为60s。之后，将小鼠移开，用电吹风机吹干毛发。所有实验小鼠连续训练5天，每个入水点训练1次，每天4次，两次训练之间休息15min。以每一天训练的4次escape lateney的算数平均值作为结果进行分析。(2)空间探索试验(spatial probe test)：定位航行实验最后一次(第5天)完成后2h，将站台从水池中撤除，小鼠进行60s的探索实验。从站台所在象限的对侧入水点将小鼠放入池中，记录其穿越站台次数，目标象限运动时间比，进而评价小鼠空间记忆能力。
[0089]
实验结果：
[0090]
如表4所示，桃叶珊瑚苷对小鼠缺血性再灌注脑损伤学习记忆缺陷的改善作用，对比sham组，vehicle组小鼠试验第2-5天逃避潜伏期增加(p《0.01，p《0.001，图4)，穿越平台次数减少(p《0.01，p《0.001，图5)，空间探索试验中跨越站台所在象限时间比降低(p《0.05，p《0.01，图6)，摄像机追踪的小鼠运动轨迹显示，sham小鼠游泳轨迹靠近站台位置，而vehicle组小鼠的运动轨迹毫无规律，沿着池壁或者远离平台运动(图6)。相比较下，lbp组小鼠试验第3-5天逃避潜伏期减少(p《0.01)，空间探索试验中穿越平台次数增多(p《0.001)、跨越站台所在象限时间比延长(p《0.05，p《0.01，)，运动轨迹规律化(图7)。
[0091]
表4桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间、穿越平台次数的影响
[0092][0093]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001
[0094]
(五)桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠海马区病理变化的影响(he染色观察小鼠缺血侧脑组织病理变化)
[0095]
实验方法：
[0096]
苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，he staining)组织石蜡切片于
70℃烘箱中烘烤2h，之后将切片依次浸泡于二甲苯ⅰ(10min)，二甲苯ⅱ(5min)，无水乙醇ⅰ(1min)，无水乙醇ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于苏木素中浸泡5min，水洗3次，在1％的盐酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，伊红溶液中浸泡2min，水速洗，之后石蜡切片继续依次浸泡于80％乙醇(30s)，95％乙醇(30s)，无水乙醇ⅰ(1min)，无水乙醇ⅱ(3min)，二甲苯ⅰ(2min)和二甲苯ⅱ(2min)，最后用中性树胶封片，每组新生大鼠脑组织石蜡切片he染色完成后，置于显微镜下观察，每张切片取
×
200视野，每个视野分别取3-6个区域进行拍照记录。
[0097]
实验结果：
[0098]
如图8-9所示，单次腹腔注射桃叶珊瑚苷对小鼠缺血再灌注所致的脑组织结构病理变化影响呈现双向反应，对比缺氧缺血模型组，随着桃叶珊瑚苷剂量增加，脑缺血区域的海马ca3区和ca1损伤性病理变化减弱，神经元数目增加，水肿、空泡样改变减弱，核固缩边集减弱。提示桃叶珊瑚苷(80mg/kg)具有减轻小鼠缺血再灌注损伤后脑组织细胞结构病理性损伤的作用。
[0099]
(六)桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠海马区病理变化的影响(尼氏染色观察小鼠缺血侧脑组织结构坏死变化)
[0100]
实验方法：
[0101]
尼氏染色(nissl staining)，石蜡切片于70℃烘箱中烘烤2h，之后将玻片依次浸泡于二甲苯ⅰ(10min)，二甲苯ⅱ(5min)，无水乙醇ⅰ(1min)，无水乙醇ⅱ(1min)，95％乙醇(30s)，80％乙醇(30s)和70％乙醇(30s)，水洗3次，之后于尼式染液中50℃烤箱孵育1h，水洗3次，在1％的盐酸酒精溶液中浸泡20s，水洗，最后用中性树胶封片，每组小鼠脑组织石蜡切片nissl染色完成后，置于显微镜下观察，每张切片取
×
200，每个视野分别取3-6个区域进行拍照记录。
[0102]
实验结果：
[0103]
如图10-11所示，单次腹腔注射桃叶珊瑚苷对小鼠缺血再灌注损伤所致的脑组织结构坏死变化影响呈现双向反应。对模型组，随桃叶珊瑚苷剂量增加缺血侧海马ca3区和ca1损伤性病理变化逐渐减弱，神经元逐渐整齐，尼氏体数量逐渐增加。给予桃叶珊瑚苷(80mg/kg)时，神经元组织病理损伤最轻，提示桃叶珊瑚苷对小鼠缺血再灌注损伤后脑组织坏死的神经元具有保护作用。
[0104]
(七)桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠海马区神经元线粒体超微结构的影响实验方法：
[0105]
模型构建24h后，腹腔注射4％水合氯醛，待小鼠麻醉后迅速断头取脑，将缺血侧脑组织切成1mm3的小块，于4℃条件下在2.5％戊二醛溶液中浸泡12h，后转至0.1m磷酸盐缓冲液中浸泡12h，然后浸泡在2％四氧化锇2h，再于梯度酒精中脱水后，用环氧树脂包埋。包埋后行超薄切片70nm，再用枸橼酸铅和醋酸铀染色，最后于透射电镜下观察海马神经元中线粒体超微结构，并拍照记录保存。
[0106]
实验结果：
[0107]
如图12所示，采用透射电镜观察桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠神经元超微结构的影响。结果表明sham ns组神经元线粒体超微结构未见改变，形态呈棒状或椭圆状，且线粒体膜和嵴结构清晰；mcao/r ns组线粒体数量减少，水肿，形态以圆形为主，线粒体嵴断
裂、溶解、消失，出现云絮样变，基质透明化，呈空泡样改变；给予au组和尼莫地平治疗后，线粒体数量增多、膜结构较为清晰、以椭圆和短棒状为主，少量线粒体嵴减少、断裂。
[0108]
实施例3动物水平探讨桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠神经保护作用机制实验分组及给药：
[0109]
将雄性icr小鼠随机分为以下8组：sham ns组、mcao/r ns组、mcao/r au(80mg/kg)组、mcao/r au(80mg/kg)组 aca(5mg/kg)组，mcao/r aca(5mg/kg)组；mcao/r h2o2(80mg/kg)组，mcao/r au(80mg/kg) h2o2(80mg/kg)组及mcao/r nim组于每天同一时间点腹腔注射给药，连续给药7天；其余各组在相同时间点给予相同体积的生理盐水，给药时间间隔均为24h/次。
[0110]
小鼠缺血性脑损伤模型的制备：
[0111]
线栓法构建小鼠mcao/r模型。第7天给药1h后，麻醉小鼠，将小鼠呈仰卧位固定在操作台面，剪去颈部皮毛，碘伏消毒，沿着颈部正中间切开皮肤，钝性分离肌肉以及左侧颈总动脉(common carotid artery,cca)、颈外动脉(external carotid artery,eca)、颈内动脉(internal carotid artery,ica)；用动脉夹暂时夹闭cca，结扎eca远端，并在cca打一活结，将线栓插入至ica内约8mm-10mm左右遇阻力时停止，将线栓固定后缝合小鼠伤口，将小鼠放置在37℃保温毯上以维持小鼠体温。1.5h后拔除线栓，待小鼠完全清醒后于常规饲养环境下饲养。
[0112]
神经功能评分：
[0113]
模型构建24h后，采用zea-longa评分评价各组小鼠的神经功能。如下：0分：无任何神经功能障碍、活动自如；1分：缺血对侧前肢不能完全伸展；2分：向缺血对侧转圈；3分：向缺血对侧倾倒；4分：意识丧失，不能行走。
[0114]
脑梗死体积的测定：
[0115]
模型构建24h后，麻醉后断头，将脑组织放入预冷的脑槽中，并放入-80℃冰箱3-5min。沿着冠状面切5片放进2％ ttc染液中，37℃恒温孵育10-15min并用镊子轻轻翻转，后加4％多聚甲醛过夜。数码相机拍照并采用image j软件分析并整理数据。
[0116]
(一)桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂aca对缺血性脑损伤小鼠的神经功能缺陷评分的影响
[0117]
实验结果：
[0118]
如表4和图13所示，与sham ns组相比，mcao/r ns组小鼠的神经功能缺陷评分显著增加(p《0.001)；与mcao/r ns组相比，mcao/r au(15mg/kg)组的神经功能评分无显著性变化，mcao/r aca(5mg/kg)组的神经功能评分无显著性变化；与mcao/r组相比，mcao/r au(15mg/kg) aca(5mg/kg)组的神经功能评分显著下降(p《0.01)。
[0119]
表4桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂aca对缺血性脑损伤小鼠神经功能评分的影响
[0120][0121]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
**
p《0.01
[0122]
(二)桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂aca对缺血性脑损伤小鼠的脑梗死体积的影响
[0123]
实验结果：
[0124]
如表5和图14所示，与sham ns组相比，mcao/r ns组小鼠的脑梗死体积显著增加(p《0.001)；与mcao/r组相比，mcao/r au(15mg/kg)组的脑梗死体积无显著性变化，mcao/r aca(5mg/kg)组的脑梗死体积无显著性变化；与mcao/r组相比，mcao/r au(15mg/kg) aca(5mg/kg)组的脑梗死体积明显减少(p《0.05)。
[0125]
表5桃叶珊瑚苷和trpm2抑制剂aca对缺血性脑损伤小鼠大脑脑梗死体积的影响
[0126][0127]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.001
[0128]
(三)桃叶珊瑚苷和trpm2激动剂h2o2对缺血性脑损伤小鼠神经功能缺陷评分的影响
[0129]
实验结果：
[0130]
如表6和图15所示，与sham ns组相比，mcao/r组小鼠的神经功能评分显著增加(p《0.001)；与mcao/r ns组相比，mcao/r au(80mg/kg)的神经功能评分下降(p《0.05)与；mcao/r au(80mg/kg)比较，mcao/r au(80mg/kg) h2o2(80mg/kg)组神经功能增加(p《0.05)。
[0131]
表6桃叶珊瑚苷和trpm2激动剂h2o2对缺血性脑损伤小鼠神经功能评分的影响
[0132][0133]
注：与sham组比较，
###
p《0.001；与mcao/r组比较
*
p《0.05，与mcao/r au组，
p《0.05
[0134]
(四)桃叶珊瑚苷和trpm2激动剂h2o2对缺血性脑损伤小鼠脑梗死体积的影响
[0135]
实验结果：
[0136]
如表7和图16所示，与sham ns组相比，mcao/r ns组小鼠的脑梗死体积显著增加(p《0.001)；与mcao/r ns组比较，mcao/r au(80mg/kg)组的脑梗死体积明显减少(p《0.001)；与mcao/r au(80mg/kg)组比较，mcao/r au(80mg/kg) h2o2(80mg/kg)组的脑梗死体积明显增加(p《0.05)
[0137]
表7桃叶珊瑚苷和trpm2激动剂h2o2对缺血性脑损伤小鼠大脑脑梗死体积的影响
[0138][0139]
注：与sham ns组比较，
###
p《0.001；与mcao/r ns组比较，
***
p《0.01；与mcao/r au比较，
p《0.01
[0140]
实施例4细胞水平探讨桃叶珊瑚苷对缺血性脑损伤小鼠神经保护作用机制细胞实验的分组、氧糖剥夺再灌注(ogd/r)损伤模型的建立：
[0141]
细胞分为空白组、对照组、ogd/r组、ogd/r au(0.01、0.1、1、10μm)组后，操作如下：
[0142]
(1)消化细胞并将细胞密度调整至105个/ml，按分组要求接种并转入37℃co2培养箱中继续培养；
[0143]
(2)24h后将需要氧糖剥夺处理的各组细胞培养基换为无糖培养基；
[0144]
(3)将细胞放入提前预热的37℃培养箱，并通入95％n2 5％co2的气体，进行气体平衡约10min查看是否漏气，然后计时开始细胞缺氧4.5h；细胞到时间缺氧结束后，将ogd/r组、空白组和对照组同时更换完全培养基，ogd/r au(0.01、0.1、1、10μm)组分别给予相应含药培养液，再放入培养箱继续培养24h后取材。
[0145]
细胞传代：
[0146]
(1)购买的细胞放进co2培养箱(37℃，5％co2)静置培养3h，观察细胞密度为85％左
右即可消化传代；
[0147]
(2)提前准备好完全培养基，pbs溶液，双抗、胰酶放入37℃水浴锅预热；
[0148]
(3)取出培养瓶，吸出旧培养基，加入3ml pbs洗涤细胞，弃取pbs溶液，重复操作2次；
[0149]
(4)加入1.5ml胰酶消化至细胞全部脱落，立即加入3ml完全培养基终止化；
[0150]
(5)将消化好的培养基转移到5ml离心管中于1000g离心机离心5min，弃上清，加入5ml完全培养基吹打均匀；
[0151]
(6)取6个60mm培养皿，将细胞悬液平均加到各个皿中，每皿中再加入3ml完全培养基，轻轻吹打混匀；
[0152]
(7)放入5％co2，37℃的培养箱培养。
[0153]
(一)桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞存活率的影响
[0154]
实验方法：
[0155]
(1)细胞传代后，取96孔板周围一圈加入100μl pbs，再用完全培养基调整细胞悬液浓度为1
×
105，用于铺板，除空白组和对照组外，各组均进行氧糖剥夺处理，之后进行复氧复糖处理，同时给药组加入au，模型组、空白组和对照组则加入相同体积的完全培养基继续培养24小时。
[0156]
(2)弃取旧培养基，每孔加入新鲜配置好的cck-8溶液(cck-8：培养基＝1：9)，5％co2，37℃的培养箱内继续孵育1.5小时，于450nm处测吸光度(od值)；
[0157]
(3)计算公式：细胞存活率％＝(实验孔od值－空白孔od值)/(对照孔od值－空白孔od值)；
[0158]
实验结果：
[0159]
如表8和图17实验结果所示，与control组相比，ogd/r组的存活率显著下降(p《0.001)；与，ogd/r组相比较，au(0.01μm，0.1μm，1μm和10μm)组细胞中，细胞的存活率明显上升(p《0.001)。
[0160]
表8桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞存活率的影响
[0161][0162][0163]
注：与control组比较，
###
p《0.001；与ogd/r组比较，
***
p《0.01
[0164]
(二)桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞内ca
2
的影响
[0165]
实验方法：
[0166]
(1)细胞传代后，取12孔板，用完全培养基调整细胞悬液浓度为1
×
102，每孔加入1ml细胞悬液，放入5％co2，37℃的培养箱内孵育24小时；
[0167]
(2)除空白组和对照组外，各组均进行氧糖剥夺处理，之后进行复氧复糖处理，同时给药组加入au，模型组和正常组则加入相同体积的完全培养基继续培养24小时；
[0168]
(3)弃取旧培养基，pbs洗涤3次；
[0169]
(4)加入fluo-4染色液(完全覆盖住样本)，放入5％co2，37℃的培养箱孵育40min；
[0170]
(5)弃取fluo-4染色液，pbs洗涤3次；显微镜下观察。
[0171]
实验结果：
[0172]
如表9和图18a、18b实验结果所示，与control组相比，ogd/r组的ca
2
荧光强度显著上调(p《0.001)；与ogd/r组相比较，au(1μm)组细胞中，细胞的ca
2
荧光强度显著下调(p《0.001)。
[0173]
表9桃叶珊瑚苷对对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞内ca
2
的影响
[0174][0175][0176]
注：与control组比较，
###
p《0.001；与ogd/r组比较，
***
p《0.01
[0177]
(三)桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞凋亡的影响
[0178]
实验方法：
[0179]
(1)细胞传代后，取12孔板，用完全培养基调整细胞悬液浓度为1
×
102，每孔加入1ml细胞悬液，放入5％co2，37℃的培养箱内孵育24小时；
[0180]
(2)除空白组和对照组外，各组均进行氧糖剥夺处理，之后进行复氧复糖处理，同时给药组加入au，模型组和正常组则加入相同体积的完全培养基继续培养24小时；
[0181]
(3)弃取旧培养基，pbs洗涤3次；
[0182]
(4)用4％多聚甲醛固定30分钟，pbs洗涤细胞3次；
[0183]
(5)用0.3％triton-x-100的pbs通透处理细胞室温孵育5min，pbs洗涤2次。
[0184]
(6)每个样本上均匀加50μl tunel染色液，37℃避光孵育60分钟(在检测样品上覆盖防蒸发膜，防止tunel染色液蒸发)，后用pbs洗3次，再次用500μl pbs重悬。
[0185]
(7)于荧光显微镜下观片、采片，再通过image j软件计算各组tunel阳性细胞数。
[0186]
实验结果：
[0187]
如表10和图19a、19b实验结果所示，与control组相比，ogd/r组的荧光强度显著增强，阳性细胞数表达明显增多(p《0.001)；与ogd/r组相比较，au(1μm)组细胞中，细胞的荧光强度明显下调，阳性细胞数明显渐少(p《0.001)。
[0188]
表10桃叶珊瑚苷对氧糖剥夺再灌注损伤后ht22细胞凋亡的影响
[0189][0190]
注：与control组比较，
###
p《0.001；与ogd/r组比较，
***
p《0.001