专利名称：巢状细胞包囊的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于在多个巢状(nested)微囊中包囊细胞的方法。标记可并入各微囊，使得根据包囊或细胞培养操作来鉴定不同的细胞群。并且，本发明提供包括多个微包囊层的微包囊的细胞，以及基于检测微包囊的标记的追踪或鉴定细胞的方法。
背景技术：
自20世纪60年代本领域就已提出了细胞的微包囊。在“cell encapsulation promise and progress”, nature medicine 9,104-107 (2003)中提供了综述。科学文献涵盖各种包囊技术和各种包囊材料。例如，在医学应用中微包囊的细胞的用途在1964年首次提出。提出了通过由海藻酸盐(酯)/i丐复合物形成的微球包囊内分泌细胞、岛(islets)、和肝细胞；见chang,、t. m. s. , artificial cells, 1972, springfield, 111. charles c. thomas。在 20 世纪 80年代，胰岛(islets of langerhans)包囊在藻酸盐(酯)_聚_1_赖氨酸_藻酸盐(酯)囊中(lim, f.和 a. m. sun, microencapsulated islets as bioartificial endocrinepancreas. science, 1980. 210 p. 908) 0通过使用更纯的藻酸盐(酯)和更粘的藻酸盐(酯)溶液，研究人员获得对正常血清免疫球蛋白不渗透的微包囊(goosen，m. f. a.等人，optimization of microencapsulation parameters semipermeabie microcapsules as abioartificial pancreas. biotech. bioeng.，1985. 27 p. 146)，从而使细胞隔绝于身体的免疫反应。还见，例如us 4，353，888。walsh等人us 6，649，384描述了转盘喷雾器包囊细胞(比如岛细胞)用于移植的用途。此专利，以及其它发表的文献和专利文件，似乎主要涵盖用于在操作期间保护细胞免于物理破坏或免于免疫系统攻击的包囊。用于培养细胞的技术和用于发现和实施用于调节细胞过程(比如生长、分化、代谢活性和表型表达)的技术的方法体现在我们的国际申请wo 2004/031369中。根据此处所述程序，例如在有孔的珠上包括一个或更多个培养细胞的细胞的“单元”，在组合分开-汇聚(split-pool)程序中经受不同生长条件，所述程序涉及反复的分开和再-汇聚细胞培养物，使其中的不同细胞单元暴露于不同的培养条件。当操作大量细胞单位时，其同一性(identity)和/或细胞培养史(例如，任何一组或单元可以已暴露的一系列培养条件的时间顺序和确切性质)可变得混淆。w02004/031369描述了用于确定细胞单元的同一性和/或细胞培养史的改进方法。在w02007/063316中我们描述了使用分开-汇聚程序用来确定试剂活性的方法，所述试剂在细胞上发挥作用。在w02007/023297中我们描述了在分开-汇聚细胞培养实验中用于标签细胞的进一步改进的方法，以更好在达到特定状态中确定细胞暴露于哪种试剂和营养物。活细胞的包囊是本领域已知的，并率先用于移植细胞的免疫-保护。通常，出于免疫-保护目的用于包囊细胞的聚合物，如本领域公知的，可用于本发明。例如，见orive等人，(2203)nature medicine 9 :104-107以及此处引用作为参考。已描述了使用喷射包囊技术的活材料的包囊。很多这种技术是本领域已知的，例如生物-电喷射、空气动力-辅助的生物-喷射以及压力-辅助的细胞喷射。这些技术每个已被描述可用于包囊活细胞。对于喷射技术的概述，见jayasinghe, s., (2008)regen.med. 3 49-61 以及 us 6，649，384、us 2006/0051329 和 us 4，353，888。并且已描述使用层-层(lbl)技术的细胞包囊。这种技术涉及多个聚电解质层至待包覆的表面上的吸附以及至彼此上的吸附。阳离子和阴离子聚电解质的连续层用于形成多层结构。例如，见 peyratout 和 daehne, (2004)angew. chem. int. ed. 43 :3762_3783。已描述了 lbl来包囊细胞的应用，例如，由leung等人，(2009)j biomed mater res a 88 226-37。leung等人采用藻酸盐(酯)/聚-l-鸟氨酸膜来包围细胞，并用聚苯乙烯磺酸盐(酯)和聚丙烯胺盐酸盐的连续层包覆此膜。表明包囊的细胞可用于长期的嫁接移植。并且，已经描述了涉及使用微流体装置包囊单一细胞或细胞簇的包囊技术。例如，见 us2006/0051329。 标记细胞(所述细胞暴露于分开-汇聚培养技术或暴露于涉及在不同培养基中反复循环培养的其它技术)，取决于能够在细胞的附上不同的标记，有赖于其所暴露的各种不同培养基。这可是极其繁重的，尤其是在分开-汇聚技术中，其中细胞群反复汇聚和再-分开至不同的群并取样大量不同的试剂组合。并且，跟随任何一个细胞经历反应条件的多重可能组合的过程可是非常困难的。已经发表了涵盖多重微囊“层”的一些专利和专利申请，通过检验，所述“层”成为包覆而不是真正的层。化学上产生这些包覆的包囊，而不是通过真正的再-包囊产生新的层。例如，见us 5，620，883。这些方法均没有被提出用于细胞标记。
发明内容
一方面，本发明提供通过微包囊细胞标记细胞或细胞群的方法，从而获得的微囊包括一个或更多个标记。因此，提供包含活细胞和标记的微囊。所述微囊可以是可用于包囊活细胞，优选不丧失细胞功能，的任何微囊。例如，微囊可以是，比如通过微流体包囊或电喷形成的藻酸盐(酯)珠、或包含聚电解质层的多层微囊。标记可以是适于标记活细胞的任何标记。标记的实例如下述。优选，细胞包囊期间加入标记。有利地，标记并入微囊层中。细胞可以是单一细胞或一群细胞。优选，其是细胞单元。在一个优选实施方式中，提供包含活细胞和多个标记的微囊，其中用两个或更多个囊层来包囊所述细胞，以及至少一个标记与两个或更多个所述微囊层结合。在这个实施方式中，例如，加入各微囊层时可加入一个或更多个标记，从而标记所述微囊。标记可并入至微囊材料本身、或和细胞共同封装至微囊中。优选，各标记可被检测。优选，可以同时检测每个标记，从而允许标记待记录的标记细胞的多个标记。另一方面，本发明提供用于细胞单元的方法，包括步骤(a)提供一个或更多个细胞单元，其中各单元包括一个或更多个细胞；以及(b)和一个或更多个第一标记共同微包囊所述细胞单元。
在一个实施方式中，所述方法还包括(c)和第二标记共同重复步骤(b)的微包囊。在步骤(c)中，步骤(b)中获得的微囊是自身包囊的。可在此阶段加入一个或更多个第二标记；标记可以是相同或不同的。第二标记和第一标记，此外，可相同或不同。各微囊可因此含有，除此之外，一个标记。以这种方式，细胞可以被连续包囊数次，每次并入不同的标记，并因此保留其所暴露的包囊事件的历史。本发明的方法当用于细胞培养操作时是尤其有利的，所述细胞培养操作涉及将细胞暴露于多个培养条件。如果包囊事件和暴露于鉴定试剂有关，那么可以确定细胞暴露的试剂的顺序。一方面，因此，提供用多个标记来标记一群细胞的方法，包括步骤a)提供一个或更多个细胞单元，其中各单元包括一个或更多个细胞；(b)和第一鉴定标记共同微包囊所述细胞单元；(c)任选，将细胞单元与一个或更多个经第二鉴定标记微包囊的细胞单元混合；(d)任选使用第三鉴定标记重复步骤(b)。第一、第二和第三鉴定标记可相同或不同。优选它们是不同的，从而不同包囊事件和特异的标记相关联。可单独、或分组地，微包囊细胞单元。换言之，微囊可含有单一细胞单元、或多个细胞单元。例如，微囊可含有2、3、4、5、6或更多个细胞单元。各细胞单元其自身可被微包囊。因此，各微囊可含有多个微囊，多个微囊中的每个可含有多个细胞单元。或者，各微囊可含有多个微囊，多个微囊中的每个包含单一细胞单
j li o微囊中若干细胞单元(或微囊)的分布有利地是同质的，但是期望可产生一些变化。有利地，本发明的方法用于分开-汇聚程序的情况下。在这种程序中，细胞可暴露于不同培养条件、汇聚、分开以及任选再-汇聚，来取样最大数目的可能条件。在这种实施方式中，本发明提供用于标记已暴露于多个培养条件的一群细胞的方法，包括步骤a)提供第一组细胞单元的群，各单元包含一个或更多个细胞，以及将所述群暴露于所需的培养条件；(b)和鉴定标记共同微包囊所述细胞单元；(c)汇聚两个或更多个所述群来形成至少一个库(pool)；(d)再重分所述库来产生另一组细胞单元的群；(d)将所述另一组的群暴露于所需的培养条件；(e)重复步骤(b) - (d)。
细胞单元可以是例如附着至微球或微孔微载体的单一细胞、或细胞群。可以通过喷射程序进行微包囊。优选技术包括生物-电喷射、空气动力-辅助的生物-喷射和压力-辅助的细胞喷射。尤其优选电喷射。作为替代的程序包括聚电解质的lbl吸附和微流体包囊。本发明采用细胞单元。这种单元可以是单一细胞，但是优选是两个或更多个细胞的集落，所述集落以这样一种形式排列，即它们甚至在分开汇聚程序期间对破坏有耐受性。例如，可以在固体基质比如珠上培养细胞，如下详细描述。典型地，所用细胞单元是小到足以通过此处所述的喷射方法被包囊的微载体。这种微载体还允许细胞用于高-通量筛选(hts)而没有任何细胞单元的事先破坏。标记允许对细胞所暴露的培养条件进行追踪；因此,任何给定细胞单元可以具有其标记阅读以便确定其如何源自起始细胞库或培养物。标记可采取任何各种形式，包括核酸标记、射频编码的标签、微球标签、条形码标签和微球标签。尤其优选微球标签。标记可选自如下组病毒、寡核苷酸、肽、荧光化合物、仲胺、卤烃、稳定同位素的混合物、条形码、光学标签、珠、量子点和射频编码的标签。两个或更多个标记可以甚至选自这样的组，并组合使用来标记细胞单元，例如，包含荧光化合物和/或量子点的珠。在我们共同-待决(co-pending)的申请w02007/023297中进一步讨论待用于细胞单元的标记和特异性标记；并入此处作为参考。 细胞可以培养于细胞单元中，各细胞单元包括一个或更多个细胞。另一个实施方式中，所述细胞单元是单一细胞。细胞单元可包括一个或更多个粘附至或结合固体基质的细胞。另一个实施方式中，所述固体基质是微载体或珠。在一个实施方式中，培养条件包括任何物理或化学培养基，在其中分离和操作细胞，但是适合的是，反应条件是细胞所暴露的培养条件。培养条件包括生长培养基、温度状况、基质、大气条件、物理细胞操作等。生长培养基包括营养并影响细胞的天然和合成的物质，包括但不限于基础培养基、生长因子、营养物、缓冲液、化学品、药物等。反应条件可甚至包括细胞信号途径的潜在调节因子的筛选。第二方面，本发明涉及微包囊的细胞单元，其包括和第一鉴定标记共同包囊于第一微囊中的至少一个细胞单元，所述包囊的细胞单元其本身和第二鉴定标记共同包囊于第
二微囊中。如上述，各微囊可包括单一细胞单元、或多个细胞单元。在一个实施方式中，因此，第二微囊包括多个微包囊的细胞单元，其中各单元可单独和其它细胞单元进行微包囊或包囊。
图ia和ib是显微照片，其显示包囊于微囊中的两个不同的微载体。图2a和2b是显微照片，其显示和图i中显示的那些相似的微载体，但是各微囊包囊有两个微载体。图3a和3b是显微照片，其显示每微囊三个微载体。图4是显微照片，其显示包囊于第一微囊中的微载体，第一微囊自身又包囊于第
二微囊中。图5a和5b是显微照片，其分别显示包囊于第二微囊中的荧光微囊，以及包囊于另一个微囊中的两个荧光微囊。图6a和6b是通过两种微流体方法形成微囊的示意图。图7是微囊中细胞单元和标记的微包囊的总示意图。图8a-8d是显微照片，其显示包囊于两层的球中的标签。图8a显示发蓝色荧光的标签，而sb显示发红色荧光的标签。合并的图像显示于sc中。8d是明视野的显微照片。用cy5. 5光学滤镜记录红色荧光图像(激发=650/45nm,发射=710/50nm)。用dapi光学滤镜记录蓝色荧光图像(激发=360/40nm，发射=460/50nm)。
具体实施例方式定义如此处所用，术语“培养条件”涉及细胞所处于的或暴露于的以便促进所述细胞生长或分化的环境。因此，本术语涉及可影响细胞生长和/或分化的培养基、温度、大气条件、基质、搅拌条件等。更具体地，本术语涉及可并入培养基且可影响细胞的生长和/或分化的特定试剂。
如此处所涉及的“细胞”，定义为能够独立运作的生物体最小结构单元或单细胞生物体，所述细胞由一个或更多个核、细胞质和各种细胞器组成，这些均被半透性细胞膜或细胞壁所包裹。所述细胞可以是原核、真核、动物或植物、或古细菌。例如，细胞可以是真核细胞。优选哺乳动物细胞，尤其是人细胞。细胞可以是天然的或比如通过遗传操作或在培养基中传代而改造的来获得所需的特性。如下将更详细地定义干细胞，干细胞是能够产生一种以上分化的细胞类型的全能、多能或专能(multipotent)细胞。干细胞可体外分化而产生分化的细胞，所述分化的细胞本身是专能的或终末分化的。体外分化的细胞是通过使干细胞暴露于一种或更多种促进细胞分化的试剂而人工创造的细胞。“细胞单元”是一群细胞，其可以是一种(细胞)的一群。细胞单元的群或库可以被分选、再重分和操作而没有实质上分解细胞单元本身，从而细胞单元表现为细胞的集落，且细胞单元中各细胞暴露于相同的培养条件。例如，细胞单元可包括附着有一群细胞的珠、或细胞团比如岛结构或胚胎体、或非粘附的细胞的集合比如某些血细胞。细胞单元(或细胞)的“群”是不连接在一起的多个这种单元。例如，细胞单元不是一群细胞，但是一个或更多个细胞共同聚集在单一单元中。单一细胞和个体细胞单元，可以被汇聚而形成一群细胞或细胞单元。群可以通过将群划分成两个或更多个细胞或细胞单元的群而被分开。“全能”细胞是具有分化成生物体中发现的任何体细胞或生殖细胞类型的潜能的细胞。因此，可以，通过一些手段，从全能细胞中衍生出任何所需的细胞。“多能”细胞是可以分化成一种以上，并非所有，细胞类型的细胞。如此处所用“标记”或“标签”是指鉴定细胞单元和/或确定细胞单元所暴露的培养条件，或培养条件的顺序。因此，标记可以是在特定的培养步骤中各自加入的一组标记；或在一开始加入的标记、或在实验(所述实验是根据细胞单元所暴露的培养步骤改造的)时加入的标记、或(细胞单元所暴露的)培养步骤期间追踪的标记；或仅仅是方位参考，其允许推导所用的培养步骤。标记或标签还可以是在任何时间报告或记录细胞单元的定位或同一性的装置、或给细胞单元指定独特的鉴定因子的装置。标记或标签的实例是独特序列、结构或质量的分子；或荧光分子或物体比如珠；或射频和其它变换器(transponder);或具有独特标志或形状的物体。“鉴定标记”是允许确定其附着的细胞单元的性质的标记。这允许通过在每次暴露时加入鉴定标记来记录细胞单元暴露的不同培养条件、以及随后通过分析标记来去卷积细胞单元暴露于的不同培养条件。当使细胞暴露于培养基、或在影响一个或更多个细胞过程(比如细胞的生长、分化、或代谢状态)的条件下生长时，细胞“暴露于培养条件”。因此，如果培养条件包括在培养基中培养细胞，那么细胞在培养基中放置足够一段时间使其有作用。同样地，如果培养条件是温度条件，那么在所需的温度下培养细胞。一个或更多个细胞单元的群的“汇聚”涉及群的混合来产生单一的群或库，其包括一种以上背景的细胞单元，即细胞单元已暴露于一种以上的不同系列的培养条件。库可以随机或非-随机地再重分为群；出于本目的，这种群其本身不是“库”，但是其本身可以是，例如暴露于不同系列的培养条件之后，通过组合而被汇聚的。“细胞生长”和“细胞增殖”此处是互换使用的，来表示细胞数目的倍增，而不分化成不同的细胞类型或世系。换言之，该术语表示活细胞的数目的增加。优选增殖不伴有表 型或基因型中的可感知变化。“细胞分化”是从一个细胞类型发展为不同的细胞类型。例如，双能(bipotent)、多能或全能细胞可分化成神经细胞。分化可伴随有增殖，或可是单独的。术语“分化”通常涉及从较低发展限定的细胞类型获得成熟细胞类型的表型(如神经元或淋巴细胞)，但不排除转分化(transdifferentiation),据此一种成熟细胞类型可转换为另一种成熟细胞类型，如从神经元到淋巴细胞。细胞的“分化状态”是细胞沿着特定的途径或世系进行分化所达到的水平。“微囊”是包封细胞单元的保护性屏障。本领域中术语通常用于涉及半透性或不透性结构；在本发明上下文中，微囊是半透性的且允许生长基质的成分和其它试剂通过，但截留标记和标签以便允许细胞单元的鉴定。微包囊、或包囊是细胞单元在微囊中的包封。当涉及微囊、或微囊中的微囊中的细胞单元数目的分布时，“基本上”用于表示赋予了规定参数的大多数所述分布；从而，如果基本上各微囊含有单一细胞单元，期望绝大多数获得的微囊将包括单一细胞单元。有些可包括两个、三个或更多个；然而，这些是相当稀少的。没有包封细胞单元的微囊不被考虑作为分布的一部分。术语“多个”表示一个以上。在涉及标记的上下文中，其描述这样的事实即各包囊允许再加入至少一个标记，从而可以用每包囊至少一个标记来标记多重-包囊的细胞单元。在涉及微囊中的细胞单元的上下文中，两个、三个、四个、五个、六个或更多个细胞单元可以包括在单一微囊中。包囊使用任何合适的技术进行包囊。已描述了微囊技术，例如在us 6，808，882和us7，138，233中，其尤其描述了乳化微包囊技术，但是还提出了其它微包囊方法，至少其中一些适于包囊活细胞。已描述了用于移植细胞的免疫保护的包囊活细胞的具体方法。例如，见orive等人，(2203)nature medicine 9 :104-107 和此处引用作为参考。适于包囊活细胞的一种方法是层-层(lbl)加入聚电解质层。在这种方法中，细胞首先包囊于微囊中，比如藻酸盐(酯)珠，随后加入交替电荷的聚电解质的层。标记可以嵌入层中，或层本身可以是被标记的。聚电解质包括，例如，聚苯乙烯磺酸盐(酯)、聚丙烯胺、聚二烯丙基甲基氯化铵(polydial lylmethylammonium chloride)、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚乙烯磺酸盐(酯)和全氟磺酸(nafion)。通过将细胞或其它待包覆的表面混悬于聚电解质溶液中来加入聚电解质层，所述聚电解质浓度足以在所述表面形成饱和的层。如果使用过量的聚电解质，其必须在加入另一个聚电解质之前除去，以避免溶液中形成复合物。如果随后以形成完整的层所需的浓度加入聚电解质，所需的微囊可以迅速形成，因为在几分钟内吸附了聚电解质且不需要洗涤循环。然而，在溶液中形成游离的聚电解质的复合物和细胞团的风险增加了。通过使用高度稀释的细胞混悬液、或精确地确定充分包覆细胞所需的聚电解质的确切量可以降低这种风险。因此，在一个实施方式中，过量的聚电解质加入至细胞。吸附各聚电解质层之后，在向细胞加入相反电荷的聚电解质之前，从溶液中除去过量的聚电解质。通过进行至少三次洗涤循环，例如用pbs，除去过量。通过离心或，优选过滤，可以进行细胞从溶液中的分离，颗粒穿过粗滤器(设计用于截留细胞材料)从过量的聚电解质中滤出。
在一个实施方式中，可使用聚电解质藻酸盐(酯)和聚-l-赖氨酸。藻酸盐(酯)和pll分别带有负电荷和正电荷。用于包囊细胞的其它聚电解质包括聚苯乙烯磺酸盐(酯)和聚丙烯胺盐酸盐。例如，见 peyratout 和 daehne, (2004) angew. chem. int. ed. 43 3762-3783 的表 2，以及 leung 等人，(2009) j biomed mater res a 88:226-37。标记或标签还可以是带电荷的；例如负电荷的标记可使用正电荷的聚电解质。在一个实施方式中，如此处所述或本领域中可以用藻酸盐(酯)包覆细胞，并随后洗涤并混悬于含有带电荷的标记的溶液中。藻酸盐(酯)是负电荷的，所以正电荷的标记将结合藻酸盐(酯)。或者，或此外，细胞可以混悬于包含正电荷的聚电解质(比如聚-l-赖氨酸(pll))的溶液中，聚电解质其自身是标记的，或者与正或负电荷的标记共同混悬于聚电解质(比如pll)的溶液中，正或负电荷的标记将分别结合藻酸盐(酯)或pll。改变混悬的时间影响层的厚度；从i分钟直至i小时的时间是可能的，但是5至10分钟的时间更常见，使用0. 05-0. iwt % pll0在例如pbs中，洗涤获得的珠，然后混悬于藻酸盐(酯)中，藻酸盐(酯)任选是标记的。再次，通常使用0. 05-0. lwt%溶液，持续5-10分钟。包囊后，洗涤珠然后按照需要重悬以加入其它包覆。在一个实施方式中，聚电解质层本身可以是可检测的。例如，可使用荧光或颜色-编码的聚电解质。见 strand 等人，biotechnol bioeng(2003)82 :386_94。在另一个实施方式中，可以在微流体控制下进行包囊。在微流体系统中含有细胞的滴的形成已得到广泛证实，并已用于高通量的基于滴的分析(j. clausell-tormos等人，chemistry and biology, 2008,15, 5,427)和细胞分选(j-c. baret 等人，lab chip, 2009,9，1850)。在这些实例中，用由油相分开的水滴中包囊细胞。通过表面活性剂层稳定水滴。而且使用若干种方法已经证实水凝胶包囊的细胞的形成。这些包括在油相中藻酸盐(酯)/细胞水滴和含有水滴的0&(12的形成。当两种类型的滴融合在一起时，形成含-细胞的交联水凝胶珠，如h. shintaku 等人,microsystems technology, 2007,13,951 的图 i 中所示，此处如图6a所重现。如下更充分描述这种方法。
方法中有两个阶段滴的形成，以及滴的凝聚形成水凝胶，如图6a中所示。对于滴的形成，首先使用通过在微通道中将水相引入至油中，从位于微通道上游的喷嘴，形成含有细胞的藻酸钠溶液的滴。跟随连续液相的流，藻酸盐(酯)滴在主通道中流向下游。然后，藻酸盐(酯)滴与从位于下游的第二喷嘴形成的氯化钙溶液滴融合。为了产生其直径在300 u m以下的水凝胶珠，通道深度优选约50 u m,分别为，对于喷嘴具有50 ii m的优选直径，以及对于主通道为200 u m。优选采用浓度在i. 5% (按重量)的藻酸钠溶液，以及细胞在藻酸盐(酯)中以io5细胞/ml的浓度分散。优选以0. im的浓度提供氯化钙。植物油比如向日葵油可用作油相。workman 等人，macromolecular rapid communications, 2008, 29,165 已描述了第二操作。在这种方法中，采用屏蔽接合(shielded junction)来产生藻酸盐(酯)微球(见workman等人中的图i，此处如图6b所重现)。混有caco3的含水藻酸钠和细胞弓i入至中央通道。混有乙酸的向日葵油提供到最外面的通道(a)。向日葵油提供到中间通道(b) 作为防止藻酸盐(酯)溶液去接触酸化油流的屏蔽。通道b和a之间，两种油以层流方式流动，具有最低程度的h 向保护的向日葵油中的扩散。在接合处形成滴之后，h 扩散至藻酸盐(酯)滴，从而从cac03中释放ca2 ，其引起藻酸盐(酯)的胶凝。接合前的通道优选具有约500 u m2的横截面积，接合后通道优选约1000 u m2。此外可以使用喷射包囊技术进行包囊。很多这种技术是本领域公知的；优选生物-电喷喷射、空气动力-辅助的生物-喷射和压力-辅助的细胞喷射。电喷也作生物-电喷或电液动力喷射(electrohydrodynamic jetting),并依赖喷嘴或针与接地电极之间的势差来产生确定尺寸的滴。培养基穿过保持在比电极更高的势的导针，设定外电场，从针中出来的培养基穿入所述电场。针是中空的，具有0. 2至2mm之间的内径,是平的或倒棱几何形的(chamferededge geometries)。针还可以是共轴的,从而不同的流可以从相同的针中同时喷出。通过针和电极之间的势差(电压的差)、培养基的流速及其相关性质比如粘度、表面张力、电导和相对介电常数确定滴的形成。电压和间距是相关的，因为电场取决于这两个变量。通常，在i或2cm间距以及电压5-10kv附近完成包囊。当喷射稳定时，可以获得几乎单分布的滴的尺寸。使用这种技术可以包囊活细胞(jayasinghe等人，(2006) small 2,216-219;和(2006)biotechnol. j. i :86-94)。尽管早期实验产生不稳定的喷射(其具有滴的尺寸的宽分布)，这通过使用共轴喷射针在外喷射中喷微包囊材料而在内喷射中喷生物材料来产生稳定的喷射而得到改善(jayasinghe 等人，(2006)lab chip 6:1086-1090)。空气动力辅助的喷射依赖于压力梯度。在室中产生相对于周围大气的压力，其提供牵引作用来产生喷射。可以这种途径包囊活细胞(arumuganathar等人，(2007)biomed.mat 2 :158-168)。压力-辅助的喷射采用共轴针，其中一个口用于喷射培养基，第二个作为待施加的压力的导管。不像空气动力-辅助的喷射，压力-辅助的喷射没有加压室(pressurisedchamber)。对于喷射技术的概述，见jayasinghe, s.， (2008) regen. med. 3 :49_61 以及us6, 649，384、us 2006/0051329 和 us 4,353,888。
待包囊的细胞可以是裸露的单个细胞，或可以是并入如上述的微载体的，比如球或有孔微载体。为了制备用于包囊的细胞单元，在一个实施方式中，细胞单元，其可以是单个细胞，在合适的含水缓冲液(比如pbs)中洗涤，沉淀并重悬于含有包囊聚合物的缓冲液中。包囊材料可以是任何合适的聚合材料。原始的包囊技术使用聚二甲基硅氧烷作为包囊材料。优选的是水凝胶，尤其是藻酸盐(酯)。聚合物应当能够易于固化来形成具有所需特性的膜，并不溶于生理ph的水或盐水。所需的特性包括体内营养渗透性，并通常需要聚合物具有一定程度的极性。聚合物膜可以通常含有处于平衡的20-90%水。聚合物应当在溶液中对细胞是无毒的。合适的聚合物的实例包括聚丙烯酸盐(酯)以及与丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的共聚物、纤维素基的聚合物、含有丙烯酰胺、n-乙烯基吡咯烷酮、苯乙烯磺酸盐(酯)、乙烯基吡啶、乙烯乙醇、烯丙醇的共聚物等。合适的聚合物是丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，带有少量季铵基团。还见us 6, 281,241 ;和desai，2002exp. opin.biol.ther. 2 :633-646。通常，对用于免疫-保护目的的包囊细胞有用的聚合物，如本领域已知的，可用于本发明。例如，见orive等人，(2003)nature medicine 9 :104-107和此处 引用作为参考。包囊聚合物优选缺乏钙离子和镁离子的pbs缓冲液(这阻止包囊聚合物的过早固化)。通常，缓冲液包括1-5重量％的藻酸盐(酯)。需要大约20ml的3%藻酸盐(酯)在pbs中的溶液来包囊ig的基于微载体的细胞单元。从pbs中沉淀之前或之后，标记或标签可以加入至包囊聚合物溶液，或加入至细胞单元。聚合物的胶凝剂可以三种方式之一引入(i)产生二级的滴群并诱导使其与细胞囊融合；(2)同油相平行建立的、含有聚合剂的水相流中提取细胞滴；或(3)胶凝剂直接溶于油相。优选，ca2 、sr2 或ba2 离子用于固化藻酸盐(酯)。cacl2或相应的sr或ba化合物，以iomm至im之间的浓度溶于水。ca、sr和ba的组合可以同少至imm的一种成分使用来获得珠的最佳特性。这种溶液优选盛放在收集容器中，所述容器置于电喷单元的电极处。混悬于藻酸盐(酯)溶液中的细胞单元穿过喷射仪器，从而滴收集于盛放固化或胶凝剂的容器中。喷后可以从容器底部回收包囊的珠。为了再-包囊,细胞单元在程序一开始已被包囊。包囊的细胞单元有利地在pbs中洗涤并沉淀。对于如上每iml体积的细胞单元(除去液体的)，使用如上制备的5ml藻酸盐(酯)溶液(优选约2重量％的浓度)。还可加入标记或标签。所述单元喷射至含有胶凝剂的容器中，且再-包囊的单元收集于容器底部。有利地，使用稍微更大的针直径，例如0. 9_来补偿增加的生物材料的尺寸。在一些实施方案中，可使用比在一级包囊程序中更高的流速和更低的场强。在一种可替代的结构中，可使用共轴喷针，细胞混悬液喷射于内针中，而包囊聚合物溶液喷射于外针中。这种排列已显示能够获得更稳定的喷射来包囊活细胞(jayasinghe&townsend-nicholson, (2006)lab chip 6:1086-1090)。标签或标记如上述，标签可用作标记。在现有技术的方法中，标签已偶联至微载体或细胞单元上，且这种方法可用于本发明的第一个巢状包囊，其中标签可以直接暴露于细胞单元。在随后的包囊中，然而，标签在细胞单元中不暴露于微载体，因此与其不形成复合物。可使用各种分子或大分子标签。标签通常包括独特形状的物体，或用标志和/或有色和/或荧光化合物改造的物体。在一个实施方案中，标签有一个或更多(优选所有)如下品质i.相对于它们所标记的细胞单元而言，它们尺寸小；ii.在不扰乱标签独特品质的条件下，它们与细胞单元可分开；其中标签不直接暴露于细胞单元，例如当它们在外面的微囊层时，通过更多种标签化学可更易于获得这种特征；iii.它们由不实质上影响细胞单元生物学的一种或更多种惰性物质制得，其反过来不受细胞单元或其生物学影响；再次，在外面的微囊层中，这可以是用更多种标签更易于获得的；iv.它们可大量的、并且以很多相关的但不同的变体的形式获得，使用合适的技术易于区分所述变体；v.它们通过方便、高度可信的方法是可区分的，且该方法可以是自动化的，例如通过facs。在一个实施方式中，标签是微球，比如荧光和/或有色微球。可以获得2000种以上的不同微球，其是通过乳化或混悬、聚合、沉淀等制得的并且由聚苯乙烯、其它聚合物、共聚物、三元共聚物和/或二氧化硅等组成。以各种尺寸、密度、颜色等制造微球，例如通过bangs laboratories inc. (fishers in, usa)。微球的常规类型是聚苯乙烯(ps)和苯乙烯/ 二乙烯苯共聚物(s/dvb)微球。其它聚合物包括聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚乙烯基甲苯(pvt)、苯乙烯/ 丁二烯(s/b)共聚物、和苯乙烯/乙烯基甲苯(s/vt)共聚物。合适地，微球是亲水微球。更合适地，微球是聚苯乙烯微球。最合适地，微球是表面-改造的微球，比如羧酸盐(酯)_改造的微球。很多这些微球可以是官能化的，例如通过如cml微球中的羧基基团、或通过氨基官能化的或含硝基的化合物，像伯、仲、叔和季脂肪胺、芳香胺和吡啶，其提供与cooh珠的可替代的偶联反应。cml微球具有源自共聚作用过程的羧基基团的高电荷表面层。表面或多或少是有孔的且相对亲水的，但保留了整个疏水特性。这些颗粒的电荷密度范围从约每羧基10至125 a2，且它们对高浓度电解质(高达-im单价盐)是稳定的。cml乳胶，将吸附蛋白质和其它生物分子，但是远不及疏水微球强。在一些实施方式中，制备微球和蛋白质的偶联物，如链霉亲和素。例如，和cml微球的偶联物可以如下制备。可使用水溶碳二亚胺试剂激活cml微球，碳二亚胺试剂使得羧基基团和蛋白质上待偶联的伯胺反应。制备50mmph6. 0的反应缓冲液。乙酸钠或2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)是合适的缓冲液。蛋白质以10mg/ml的浓度溶于反应缓冲液。在反应缓冲液中制备1% (w/v)微球混悬液。制备一体积的蛋白质溶液对十体积的微球混悬液，将混合物在室温孵育20分钟。制备10mg/ml(52 ii mol/ml) i-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edac)在去离子水中的溶液，并即刻使用。向微球 混悬液中加入计算量的edac溶液，且用0. in naoh将反应混合物的ph调整至6. 5±0. 2。室温下在摇床(rocker)或混合轮(mixing wheel)上孵育混合物2小时。除去未结合的蛋白质并保存于保存缓冲液中。优选，可以各种形式获得cml和其它微球，比如各种颜色(如蓝、红、绿、黄、黑)、各种荧光团(如荧光素(绿)、荧光素(红)或荧光素和罗丹明(红和色))以及各种尺寸(如 5.4iim(l. 14x1010 珠/ 克)以及 7.6iim(4. 10xlo9珠 / 克))。可制备cml-和其它微球，从而它们加载有一种或更多种可视染料和/或荧光团。
在一些实施方式中，标签，比如微球，未包覆有蛋白质。通过改变建造过程中的各种参数，商业微球供应商-比如bangs laboratories-可以制造珠的套装,其可以基于不同尺寸而被区分(如4.4iim和5.5iim直径的珠的套装)。各尺寸组内的珠可进一步基于不同的荧光强度(由于单一荧光染料的载量(loading)不同)而彼此区分。可能使用具有不同吸收或发射特征的很多不同染料，其可以附着至此处所述的微载体上。因此，不同的标签尺寸和/或荧光团载量(荧光强度)、和/或荧光团同一性/组合可导致标签多样性。尤其是，它们携带的荧光团类型(如珠可加载有uv25或starfire red);尺寸(如，对于各荧光团有5种不同的珠尺寸1. 87,4. 41,5. 78,5. 37和9. 77微米)和/或它们携带的荧光团的量(各染料的五种不同强度是可获得的)可导致标签多样性。可以使用其它荧光团-比如tritc0然后可以使用滤镜来检测任何给定珠上的至少4种不同染料，比如针对来自nikon 的 tritc visualization 的 tritc 滤镜(ex 540/25 ；dm 565 ；ba 605/55);针对来自 nikon 的 uv2visualization 的 dapi 滤镜(ex 340-380 ；dm 400 ；ba 435-485);针对来自 nikon 的 fitc visualization 的 gfp-b 滤镜(ex 460-500 ；dm 505 ；ba 510-560)以及针对 strarfire red visualization 的 cy5 滤镜套装(来自 chroma technology 的 cat-no4t008)。微球可以用可视或荧光染料进行内部或外部染色。当染料整合至微球体(mass)时发生内部染色，通常通过将微球浸泡至含有染料或荧光团的溶液中。当染料偶联至微球表面时，发生外部改造，例如用此处所述的异硫氰酸盐(酯)衍生物对cml微球的改造。因此，在一些实施方式中，可以用可视或荧光染料对微球进行内部或外部染色。还可能使用“量子点”来获得非常大量的可以方便读取的不同荧光标记。从而在本发明另一实施方式中，使用量子点而非荧光团。在某些实施方式中，由于事实上，当暴露于光时量子点不消退(光-漂白)，优选量子点。例如已知荧光团fitc是光-漂白的，并且用含有fitc的标签处理的细胞单元最好在黑暗中操作且难于稳定分析。可在聚合聚苯乙烯的时候将量子点并入微球，导致甚至是标签的加载。可以很多颜色获得量子点，它们可以在相同的波长激发，从而通过使用颜色ccd照相机无需滤镜就允许多重颜色的可视化。量子点的进一步背景信息从 us 6, 322, 90uus 6, 576, 29uus 2003/0017264,us 6.423,551、us 6，251，303、us 6，319，426、us 6，426，513、us 6，444，143、us 2002/0045045、us5，990，479、us 6，207，392、us 6，251，303、us 6，319，426、us 6，426，513 和 us 6，444，143可获得。通过本领域技术人员熟悉的各种方法可以实现标签的检测。方法包括质谱、核磁共振、测序、杂交、抗原检测、电泳、光谱、显微术、图像分析、荧光检测等。在一些实施方式中，由于标签通常含有颜色或荧光团，因而使用显微术、光谱、图像分析和/或荧光检测。可以原位进行标签的检测，就是说不扰乱包囊的细胞的结构，或可以在从囊中分离标签之后进行。原位检测标签的优势是可能利用组合的标签策略。例如当使用标签a、b和c时，除了仅含有标签a、b和c的层以外，将可能产生含有独特标签组合(ab、ac和bc)的不同包囊层。在一个实施方式中，层还含有第二个易于检测的区分因子(differentiator),比如染料，其另外允许不同层得以区别。在一个实施方式中，标签的包囊可导致空间上编码的聚合物基质；例如，见美国专利申请 20060127369。标签策略的多个变化可以被设计用来确定混合物中给定细胞单元的同一性或推导混合物中包含的不同细胞单元的同一性。例如已经描述了标签的光学或可视方法，其中不同形状的物体、图像编码的物体或不同颜色指示样本的同一性(例如见，guiles等人，1998, angew. chem. intl ed engl, vol. 37, p926 ；luminex corp, austin tx, usa ； bcpbiosciences ；memobead technologies, ghent, belgium)。在另一个实施方式中，标签是杆状颗粒。合适地，杆状标签是纳米线。所述纳米线可包括、由或主要由各种金属(比如铝)组成。可用各种金属(比如银和/或金)包覆纳米线。合适地，纳米线约i u m或更小的直径和/或约10 ii m或更小的长度。纳米线可以是science, voi 294, p. 137-141 (2001)中描述的纳米线。简要而言，纳米线是用亚微米条(submicrometer stripe)固有编码的多金属微杆。通过金属离子在具有统一尺寸的孔的模板上连续电化学沉积可以产生复杂的图案。优选，纳米线足够小以便用作可在各次分开后加入的标签。杆状颗粒(比如纳米线)的参数包括但不限于尺寸、光学特性和/或金属组合物。在一个实施方式中，光学特性选自光反射性，比如特定波长的光反射性、颜色、荧光发射-波长和荧光发射强度。在一些实施方式中，杆状颗粒，比如纳米线，是外部染色的。杆状标签可优选是球形标签，由于更高的表面面积对体积的比例，导致在微囊层中出色的保留。因此，纳米线的结合可以优于，例如，微球标签的结合，并产生更水平的标签。对于一些实施方式,标签不是dna标签。在一些实施方式中，标签是外部染色的标签。在另一实施方式中，标签使用无线波来传输信息，如在rfid标签中。rfid通常采用变换器(rf标签)、天线和读取器。rf标签是小的电子线路，通常包装在玻璃或塑料中，rf标签以其最小的形式提供通过合适电子设备对可“读”的独特鉴定编码的访问(access)，而无需接触或视线(line of sight)。标签还可以储存用户产生的信息，同样地无需接触或视线。“读取器”是将信息转化为标签以及转化来自一个或更多个标签的信息的电子单元(应当注意，术语读取器可互换使用，来表示只读和读/写单元)。读取器的尺寸和特征可显著不同，其可以分开操作，或连接至远程计算机系统操作。天线用来将信息从读取器传输至标签，并接收rf标签发送的信息。天线的尺寸和形式将反映专门的应用，范围可从小的环形线圈至大的平面结构。rfid系统可以分开操作，或连接至远程计算机操作用于鉴定和源自标签的相关数据的更全面的解释和操作。一个rfid策略描述于nicolaou等人(1995,angewchem intl ed engl, vol. 34, p. 2289)并包括(i)含有合成基质和半导体标签的有孔包封(enclosure) ；(ii)固相合成树脂；(iii)能够接收、储存和发射射频信号的玻璃-包装的单个或多个可寻址的射频标签半导体单元。仅通过用组织培养微载体或合适的细胞单元替换固相合成树脂，可以调整相似的装置来适于细胞单元生长和追踪。可以设想的这种的更多变化包括但不限于细胞直接生长于其上的(包覆的或未包覆的)rf标签，或植入细胞单元或生物体的rf标签。标记的微囊壁在一个作为替代的、或互补的，标记策略中，标记可以并入材料中，从所述材料构建微囊壁。例如，荧光-标记的聚合物可用于包覆细胞。如果聚合物是藻酸盐(酯)，例如，可以通过让羧基暴露于藻酸盐(酯)，用藻酸盐(酯)处理标记比如氨基荧光素(c2tlh13no3)。可以用商业蛋白质标记试剂(比如来自molecular probes (leiden,荷兰)的alexa 546蛋白标记试剂盒)来标记聚-l-赖氨酸(pll)。例如，见strand等人，biotechnolbioeng (2003)82 :386_94。
荧光染料可用于标记聚电解质，比如那些在lbl包囊中使用的。见，例如，us2006/0105335，其中异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明-异硫氰酸酯和cy5的衍生物用于标记聚烯丙胺(pah)。通常，根据标记蛋白质的常规操作标记聚电解质。微载体可获得各种微载体，范围从形状和尺寸以及由不同材料制得。微载体可以是有孔的、大孔的、微孔的或固体的。通过实例的方式，微载体可以是选自如下的微载体cultisphe 微载体、cultispher-g 微载体、cultispher-gl 微载体、cultispher-s 微载体、informatrix 微载体、microsphere 微载体、siran 微载体、fibracel disks 微载体、cytoline微载体(如cytoline i微载体或cytoline 2微载体)、cytodex微载体(如cytodex i、cytodex 2 或 cytodex 3 微载体)、cytopore 微载体(如 cytoporel 微载体或cytopore 2 微载体)、biosilon 微载体、bioglass 微载体、fact iii 微载体、collagen c微载体、hillex ii微载体、pronectin f微载体、plastice微载体、plastic plus微载体、nunc 2d microhex 微载体、glass 微载体(sigma aldrich)、de 52/53 微载体或其组合。细胞和细胞单元细胞并入至细胞单元中导致形成一个整体，当与其它集落掺搅和混合时，有助于细胞的群(细胞集落)在细胞培养中在各种条件下生长以及在各种条件下维持群的整体性。这种群或集落此处涉及细胞单元。通过说明的方式，通过使细胞作为粘附培养物生长于固体基质(比如载体)上，可以实现细胞单元的形成。如果接种在载体上之后发生细胞增殖，子代细胞将附着至相同的载体，并形成相同集落的一部分。通常，活的粘附的细胞不易于从其生长基质中分离，所以，尽管载体的任何机械操作、培养培养基的搅动、或转移至另一组织培养系统，仍保持了细胞集落的整体性。相似地，如果在任何时间将多个载体置于相同的容器中(如汇聚珠)那么将没有细胞从一个珠到另一个珠的实质转移。当在固体基质上形成细胞单元时，基质以及因此由于结合的原因而附着的细胞，可以如此处所述被标记。生长于更小的载体上的细胞可以作为混悬培养物处理。在更小的载体上生长细胞的常规方法涉及微载体细胞培养(见“microcarrier cell culture”，principles and methods' , edition aa,可获自 amersham biosciences (18-1140-62);其全部并入此处作为参考)。微载体培养商业上用于高达4000升的发酵罐中抗体和干扰素的生产。包囊细胞单元的优点是显著降低了细胞(或标签)从一个单元向另一个单元的任何转移。由于载体的物理特性是已知的，容易计算实验中所用载体的数目。载体可作为干的产物获得，其可以精确称重，并随后通过溶胀于液体培养基中而制备。此外，可以算出并改变用于接种微载体培养基的细胞的数目。收获生长于此处所述微载体上的细胞，或当需要时从微载体中释放标记，可以如此处所述适用时通过细胞的酶促解吸附，和/或通过消化载体来实现。在一些实施方式中，标签是球，比如微球，其包括聚苯乙烯、由或主要由聚苯乙烯组成。细胞可以是任何细胞，包括分化的细胞、祖细胞或干细胞，多能的或全能的。 在一个实施方式中，排除人胚胎干细胞。例如，在w02004/031369、w02007/063316和w02007/023297中描述了可以包囊的细胞的类型，其中每个并入此处作为参考。试剂盒本发明还涉及用于细胞包囊的试剂盒。这样的试剂盒包括至少藻酸钠、一个或更多个微载体以及一个或更多个可检测的标签。藻酸盐(酯)可以是固体或溶液形式，并且溶液可以是即用型或预期用于稀释的。微载体和标签可选自上述那些。试剂盒还可包括，例如，适合细胞的包囊的微流体喷嘴或喷针，例如此处所述的，包囊聚合物，比如上述的适于喷射的聚电解质或聚合物，以及胶凝剂，其通常是钙、锶或钡离子。用于包囊的细胞可还包括在试剂盒的一部分，如同培养基，比如dmem或pbs。可以设计专门的试剂盒用于通过lbl、电喷或微乳化技术的包囊。各试剂盒优选包括藻酸盐(酯)、标志物和微载体；然而，聚合物和培养基可根据应用的不同而不同。例如，设计用于电喷包囊的试剂盒可包括，除了藻酸盐(酯)以外，标签和微载体、一种或更多种成分选自聚丙烯酸盐(酯)以及与丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯的共聚物、纤维素基的聚合物、含有丙烯酰胺、n-乙烯基吡咯烷酮、苯乙烯磺酸盐(酯)、乙烯基吡啶、乙烯乙醇、烯丙醇的共聚物以及丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，带有少量季铵基团。试剂盒可包括胶凝齐u，其优选包括ca2 、sr2 或ba2 离子。还包括的可以是一个或更多个喷针，其优选具有0. 2至2mm之间的内径，并且是平的或倒棱几何形的。设计用于lbl的试剂盒可包括，例如，除了藻酸盐(酯)以外的一种或更多种聚电解质溶液、标签和微载体。细胞的组合的系列培养分开-汇聚细胞培养此外形成细胞单元(尤其是显微细胞单元)对于取样多组织培养条件是有用的，因为各细胞单元构成可暴露于各种细胞培养条件的易于操作的单元。根据本发明，通常通过在微载体培养中生长细胞来产生细胞群，以及术语细胞单元、细胞群、集落和珠用于描述微载体细胞培养的成分。用于取样大量细胞培养条件尤其高效的方法涉及组合的细胞培养或分开-汇聚细胞培养，并且在一个实施方式中涉及系列的再分和合并细胞单元的群以便取样细胞培养条件的多重组合。在本发明的一方面中，通过将细胞单元的最初起始培养(或不同起始培养)划分至xi数目的等份，各份含有在不同培养条件下分开生长的多个珠(群/集落/载体)，来实施方法。细胞培养一给定时间之后，可用特异的标记包囊细胞单元，然后可以通过组合和混合来自不同等份的珠汇聚细胞单元。该库可以再次分开至x2数目的等份，各等份在不同条件下培养一段时间，用另一特异的标记(其可以是相同的或，优选，不同的)包囊，然后再汇聚。这种细胞单元的分开、培养、包囊和汇聚(或汇聚、分开和培养；取决于从何处进入循环)的反复程序允许系统性取样很多不同细胞培养条件的组合。实验的复杂性，或换言之待测试的不同细胞培养条件组合的数目，等于各轮取样的不同条件的数目的乘积(x1xx2x…xn)。注意的是，在随后分开之前汇聚所有细胞单元的步骤是可选的；其中汇聚有限数目的细胞单元的步骤可以具有相同的作用。因此本发明体现了细胞培养条件多重组合的系统性取样的多种相关方法，其中批量操作细胞单元群。各轮细胞培养之后，或确定数目的轮之后，可以分析细胞单元来确定是否有成员展现出增加的细胞增殖或特定表型或基因型。这可以通过各种技术来实现，例如通过在显微镜下视觉检查细胞单元，或通过对细胞特有的标志物产物进行定量。这可以是内源性标志物比如特定dna序列、或可以通过配体或抗体检测的细胞蛋白质。作为替代，外源性标志物，比如绿色荧光蛋白(gfp)，可引入至要分析的细胞单元来提供特定的实时(活)细胞读出。相反地，死细胞可以使用各种方法标记，例如使用碘化丙碇。此外，标记的细胞单元可 以从未标记的细胞单元中通过各种技术分离，人工的和自动的，包括荧光激活的分选，例如使用 copas 设备(union biometrica)。分开-汇聚(和分开-分开)培养操作的其它实例可以在w02004/031369、w02007/063316和w02007/023297中找到，各文献并入此处作为参考。出于说明的目的，在如下实施例进一步描述本发明。实施例i藻酸盐(酯)溶液的制备粉末形式的藻酸盐(酯)混合至去离子水或磷酸盐缓冲盐水-cacl2-mgcl2(pbs—)(没有ca或mg离子的pbs溶液)中，给出按重量百分比为1-5%之间的藻酸盐(酯)混合物。使用约20ml的每g微载体以3%溶于pbs。搅拌混合物直至完全溶解。然后溶液进行高压灭菌或无菌过滤来确保溶液无菌。固化溶液的制备ca2 、sr2 或ba2 离子将和藻酸盐(酯)溶液交联成水凝胶。通过将cacl2以200mm的浓度溶解于水中制备固化溶液。用磁力搅拌器搅拌溶液直至完全溶解。包囊器(encapsulator)的准备使用nisco包囊器(nisc0 engineering ag，瑞士)进行包囊。如果之前没有进行，清洁并消毒仪器和其所有成分，使用新的硅酮管。选择具有0. 8mm内径且平端几何形(相对于倒棱的)的针，插入至喷射仪器的鲁尔锁头(luer lock)并用手弄紧。地电极插入至组装体(assembly)，弄紧螺丝并连接地电极缆。或者，电极接电，而针接地。针端到电极的间距设定为2cm，使用7kv的电压。cacl2溶液置于小烧杯中，烧杯在针的下面包括磁力搅拌-棒。内-置的磁力搅拌器设为30 %并在这一点上开启。来自组装体的接地电极棒伸入至液体中，从而使其接地，来阻止液体带电并排斥滴。混悬液的制备待包囊的单元，其是来自之前包囊步骤的微载体、细胞(簇或分散的)或珠，用pbs洗涤，弃去液体并重悬于藻酸盐(酯)溶液中。iml的这种混悬液带入至注射器中，并直接注射至包囊器的管中。通过这样做，避免了注射器中珠/微载体的沉淀(settling)。喷射的准备第二注射器填装有纯的(plain)藻酸盐(酯)来推待包囊的材料，注射器连接至注射器泵。注射器泵的流速设为5ml/h。可使用约l_20ml/h范围中的流速。喷射为了喷射滴，按照仪器的说明书，施加跨针和电极的电压。可以重复程序，制备更多的珠并将它们注射至仪器，以便包囊更多的材料。珠的回收当完成过程时，关闭注射器泵、电压和磁力搅拌器，移开含有交联溶液和包囊的收集烧杯。包囊沉淀在烧杯底部，并可以移至falcon管或其它容器。珠用pbs洗涤若干次，并重悬于所需的溶液(pbs、dmem等)中。结果显示于图i至4中。
_9]仪器设定和变量包囊微载体
权利要求
1.一种微囊，其包括活细胞和标记。
2.根据权利要求i所述的微囊，其包括细胞单元。
3.根据权利要求i或权利要求2所述的微囊，其中所述标记是rfid标记。
4.根据权利要求i或权利要求2所述的微囊，其包括两个或更多个囊层。
5.根据权利要求4所述的微囊，其中所述两个或更多个囊层各自包括一个或更多个标记。
6.根据任意前述权利要求所述的微囊，其中所述微囊是由层-层加入聚电解质囊形成的。
7.根据权利要求i至5任一项所述的微囊，其中所述微囊是通过喷射包囊形成的。
8.根据权利要求i至5任一项所述的微囊，其中所述微囊是通过微流体包囊形成的。
9.根据任意前述权利要求所述的微囊，其中所述微囊是由聚合物组成的，组成囊层的聚合物通过并入荧光染料而被标记。
10.一种标记细胞单元的方法,包括步骤 (a)提供一个或更多个细胞单元，各单元包括一个或更多个细胞；以及 (b)和一个或更多个第一标记共同微包囊细胞单元。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括(c)和第二标记共同重复步骤(b)的微包囊。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述第一标记和第二标记是不同的。
13.一种用多个标记来标记一群细胞的方法，包括步骤 a)提供第一群一个或更多个细胞单元，各单元包括一个或更多个细胞； (b)和第一鉴定标记共同微包囊所述细胞单元； (c)任选，将细胞单元与已经和第二鉴定标记微包囊的一个或更多个细胞单元混合形成第二群； (d)使用第三鉴定标记，用第二群重复步骤(b)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一、第二和第三标记中的至少两个是不同的。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述第一群细胞单元在步骤(c)之前或之后分裂至两个或更多个群。
16.根据权利要求13至15任一项所述的方法，其中所述细胞单元的群暴露于不同培养条件。
17.—种标记暴露于多个培养条件的一群细胞的方法，包括步骤 a)提供第一套细胞单元的群，各单元包括一个或更多个细胞，以及将所述群暴露于所需的培养条件； (b)和鉴定标记共同微包囊所述细胞单元； (c)汇聚两个或更多个所述群来形成至少一个库； (d)再重分库来产生又一套细胞单元的群； (d)将所述又一套的群暴露于所需的培养条件； (e)重复(b)-(d)。
18.根据权利要求13至15任一项所述的方法，其中通过喷射程序进行微包囊，所述喷射程序任选选自生物-电喷射、空气动力-辅助的生物-喷射和压力-辅助的细胞喷射。
19.根据权利要求13至17任一项所述的方法，其中通过层-层加入聚电解质进行微包囊。
20.根据权利要求13至19任一项所述的方法，其中所述细胞单元包括至少一个微载体和一个或更多个细胞。
21.根据权利要求10至20任一项所述的方法，其中所述标记选自荧光化合物、仲胺、稳定同位素的混合物、条形码、光学标签、珠、量子点和射频编码标签。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述标记是微球。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养条件选自生长培养基、温度状况、基质、大气条件和物理细胞操作。
24.根据权利要求10至23任一项所述的方法，其中基本上各微囊含有单一细胞单元。
25.根据权利要求10至23任一项所述的方法，其中基本上各微囊含有多个细胞单元。
26.根据权利要求10至23任一项所述的方法，其中各微囊含有多个细胞单元，各细胞单元本身是各自被微包囊的。
27.一种微包囊的细胞单元，其包括与第一鉴定标记共同包囊于第一微囊中的至少一个细胞单元，所述包囊的细胞单元其本身与第二鉴定标记共同包囊于第二微囊中。
28.根据权利要求27所述的微包囊的细胞单元，其中所述第二微囊包括多个微包囊的细胞单元。
29.一种用于包囊细胞单元的试剂盒,包括 (a)微载体； (b)可检测的标签； (c)藻酸钠；和任选地 (d)聚电解质。
全文摘要
本发明涉及包囊活细胞和标记的方法，以及用于进行这种包囊的包囊的标记的细胞和试剂盒。包囊的细胞可用于多重平行的组织培养实验，其中各微囊中的标记可用于解码经过一系列培养步骤的细胞途径。
文档编号a61k9/16gk102713613sq201080047567
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月22日 优先权日2009年10月22日
发明者c·j·约翰逊, p·k·奥登瓦尔德, s·n·贾亚辛哈, y·初 申请人:可塑细胞有限公司