专利名称：：来自破囊壶菌属(thraustochytrid)的△6去饱和酶及其用途的制作方法来自破嚢壶菌属(77zmmstoc/^加v0的a6去饱和酶及其用途发明领域本发明涉及从裂殖壶菌(5b/n'zoc/^n'mm)分离的a-6去饱和酶基因。本发明进一步涉及在酵母中克隆来源于裂殖壶菌的a-6去饱和酶。揭示了a-6去饱和酶的核酸序列和氨基酸序列。进一步揭示了构建体、包含与异源调节序列功能性组合的编码a-6去饱和酶这种酶的基因的载体。所述新型a-6去饱和酶可用于将亚油酸转化为y亚麻酸的代谢途径(co-6途径)。本发明提供来自裂殖壶菌的这些编码上述蛋白质的新型核酸的鉴定、分离。本发明具体列举了带有包含该a-6去饱和酶基因的载体的重组酵母细胞，其依靠所产生的酶将能够产生？亚麻酸。可将使用该酶生产的多不饱和脂肪酸加入到药物组合物、营养组合物、动物祠料以及其它制品例如化妆品中。发明背景△-6去饱和酶是合成高度不饱和脂肪酸例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸所需的关键酶。n-6途径的主要代谢产物是花生四烯酸(20:4n-6)，而n-3途径的主要终产物是二十碳五烯酸(epa)(20:5n-3)和二十二碳六烯酸(dha)(22:6n-3)。20碳和22碳(n-6)和(n-3)多烯脂肪酸的可得性(availability)主要取决于a-6去饱和酶使18:2(n-6)和18:3(n-3)去饱和的速率。a-6去饱和酶是孩t粒体酶，^皮认为是包括nadh-细胞色素b5还原酶、细胞色素b5和a-6去饱和酶的三酶系统中的组分。a-6去饱和酶催化pufa合成的第一步、也是限速步骤。它对于通过去饱和延长途径的脂肪酸流起闸门的作用。尽管其可作用于任何长链脂肪酸，但底物结合亲合力随着业已存在的双键数目而大大增加。最近鉴定的人缺乏a-6去饱和酶的病例强调了该途径的重要性(nakamura等，2003)。不饱和脂肪酸例如亚油酸和a-亚油酸为不能由脊推动物合成的必需饮食成分，因为脊推动物细胞能在脂肪酸的a-9位引入双键，但不能在脂肪酸的a-9和曱基末端之间引入另外的双键。因此很显然，动物不能在△-9位以外的地方去饱和，因此不能将油酸转化为亚油酸，同样地，哺乳动物不能合成y-亚麻酸。因为亚油酸和a-亚油酸为其它产物的前体，所以它们是必需脂肪酸(不能由机体合成并因此需要构成饮食的部分)，并且通常由植物来源获得。哺乳动物可将亚油酸转化为y-亚麻酸，后者可进而转化为花生四烯酸(20:4),花生四烯酸是一种极为重要的脂肪酸，因为其为大部分前列腺素的必需前体。此外，由亚油酸、a-亚麻酸和油酸转化为高度多不饱和脂肪酸的动物生物转化，主要由a6和a5去饱和酶经由饮食和激素刺激机制来调节。(prostaglandinsleukotessentfattyacids68(2):151-62.)。由于前述原因，对a-6去饱和酶这种酶、编码该酶的相应基因、包括生产该酶的重组方法存在明确的需求。通过饮食摄入富含这样的pufa的植物来源，目前业已满足对这些必需脂肪酸的需求。^f旦存在不足之处，因为这些天然来源在可得性上总是遭遇无法控制的波动。而且，植物油具高异质性组成，需要大量的纯化程序来分离特定的目标多不饱和脂肪酸(us20060035351)。然而，为满足日益增长的全球人口的需求，不得不探索成本有效的替代物。本发明涉及将编码分离自海洋生物裂殖壶菌的a-6去饱和酶的基因导入到酵母，以生产脂肪酸，例如y-亚麻酸、十八碳四烯酸和在co-3/co-6脂肪酸生物合成途径中由各自底物生物转化产生的其它脂肪酸。酵母作为在合适的培养基中表达脂肪酸的良好系统，提供了大量优势。很久以来酵母就被公认为蛋白质表达宿主，并用作蛋白质表达宿主，因为其可提供加工系统连同方便使用的微生物系统。作为宿主，其拥有许多优势，因为其既可用于生产分泌型蛋白，又可用于生产可能需要翻译后修饰的胞质蛋白，其生物合成途径在很多方面象高等真核细胞。而且，与其它真核系统相比，对其遗传学的了解要深入得多，且其与大肠杆菌(e.co/t)相似，易于操作。表达水平也在每升培养物几个毫克的范围内。业已鉴定了很多a-6去饱和酶。在植物例如牧草琉璃苣(boragoofficianalis)中，业已鉴定出a-6去饱和酶(sayanova等，1997)。在人类(hyekyung等，l"9)、动物例如线虫秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)(michaelson等，1998和napier等，1998)和真核微生物例如真菌高山被孢霉(mortierellaalpina)(hunag等，1999和knutzon等，1998)中，同样业已鉴定a-6去饱和酶。按照本发明所述方面，提供包含编码分离自海洋生物裂殖壶菌的a-6去饱和酶的dna序列的分离的核酸分子。发明简述本发明涉及分离的编码具有去饱和酶活性的多肽分子的核酸序列或其片段，其核酸序列示于seqid.no.1中，其氨基酸序列示于seqid.no.2中。本发明包括分离的核s吏序列或其片段，其包含与seqid.no.l所示核苷酸序列具有至少70%、优选80%、更优选90%核苷酸序列同一性的核酸序列，或与所述核酸序列互补。本发明还包括分离的编码具有去饱和酶活性的多肽的核酸序列或其片段，其中所述多肽包含与seqid.no.2所示的氨基酸序列具有至少70%、优选80%、更优选90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。上述核苦酸序列编码用单不饱和或多不饱和脂肪酸作为底物的功能活性的a-6-去饱和酶。该核苷酸序列分离自裂殖壶菌sc-1。另外，本发明包括鉴定、分离和克隆编码a-6去饱和酶的核酸序列和氨基s吏序列的方法，该方法包括如下步骤(1)用部分s-4去饱和酶基因进行cdna文库筛选，导致鉴定出部分cdna克隆；(2)用该部分cdna克隆筛选裂殖壶菌sc-1的bac文库，以^使鉴定阳性bac克隆；(3)对阳性bac克隆进行鉴定和测序，进一步鉴定全长序列内的a-6去饱和酶orf;(4)构建包含与seqid1所示序列有至少90%序列同一性的载体；(5)通过转化，在足以表达所述去饱和酶的条件和时间下，将所构建的载体导入宿主细胞中。宿主细胞可为例如真核细胞或原核细胞。原核细胞可为例如大肠杆菌，原核细胞可为例如真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或才直物细月包，{旦优选酵母细月包，例如酉良酒酵母(sacc/^row少cescerev/w'ae)。其它合适的宿主细胞可包括解脂耶氏酵母(7amnv/a印o/,'ca)、假丝酵母(ca"(i油w)、汉逊酵母(/7a"化"w/"s//)等等。本发明具体实施方案阐述了包含编码具有a-6去饱和酶活性的多肽的核香酸序列或其片段的载体的构建，其中所述多肽包含与seqid.no.2所示序列具有至少70%、优选80%、更优选90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其在最佳条件下操作性连接到调节序列(例如启动子和终止子)，以便表达酶△-6去々包和酶。另外，本发明包括包含以上载体的酵母细胞，其中a-6去饱和酶的表达导致产生？亚麻酸。本发明的再一方面涉及对表达a-12和a-6去饱和酶的酵母克隆的诱导，显示出形成亚油酸和y亚麻酸。由芥菜cbra^/cay，cae)a-12去饱和酶在体内将油酸转化为亚油酸。随后由克隆的sc-1a-6去饱和酶催化，使亚油酸去饱和为y亚麻酸。在所述发明范围内，实验证明了sc-1a-6去饱和酶在酵母中的功能表达。附图和序列的详细说明图1:sc-1的a-6去^l和酶与其它已知a-6去^l和酶的聚类。(注意在所有物种中组氨酸基序的存在对去饱和酶的功能必不可少)。图2:sc-1的a-6去饱和酶中存在脂肪酸去饱和酶基序和细胞色素(cytocrome)b-5结构域。图3:a-6去饱和酶(全长)与用ecori(e)和psti(p)消化的sc1基因組dna的dna印迹杂交；m-lkb序列梯。(杂交结果清楚地表明，sc-1中存在单拷贝的a-6去饱和酶。)图4:构建体pet-sc-1-d6的图谱。图5:用gall引物扩增所述克隆。图6:含有mcsi中的a-6去饱和酶和mcsii中的a-12去饱和酶的pesc-trp构建体的图谱。该构建体称为pet-d6scl-d12bj-co。图7:从pet-d12-d6构建体扩增a-12和a-6去饱和酶(泳道m:1kb序列梯；1:a-12去饱和酶的扩增，和2:a-6去饱和酶的扩增。)seqid.no.1:分离自裂殖壶菌sc1的△-6-去饱和酶的核酸序列。seqid.no.2:分离自裂殖壶菌sci的a-6-去饱和酶的氨基酸序列。发明详述通过a-6去饱和酶将亚油酸转化为亚麻酸。本发明涉及分离的编码a-6去饱和酶的核酸序列。本发明更具体地涉及来源于海洋生物裂殖壶菌的a-6去饱和酶基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，其中所述基因通过筛选裂殖壶菌的bac文库而得到。本发明进一步涉及将包含本发明核酸片段或其编码功能酶的部分连同指导其mrna转录的合适的调节序列的载体转移到活细胞，藉此引起特定的a-6去饱和酶的产生，导致将亚油酸转化为y-亚麻酸，在本发明上下文中所述活细胞为酵母细胞。在本发明上下文中将使用大量术语。提供以下定义以便更好地限定本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另外指出，否则术语应该按相关领域普通技术人员的常规使用来理解。去饱和酶去饱和酶是促进烃分子中形成碳-碳双键的酶。脂肪酸去饱和酶本文所用术语"脂肪酸去饱和酶"指催化碳-氢4建断裂并将碳-碳双键引入到脂肪酸分子的酶。脂肪酸可为游离的，或酯化到另一分子，所述另一分子包括但不限于酰基载体蛋白、辅酶a、固醇类和甘油脂的甘油部分。"a-6去饱和酶"指催化在12和13位碳(从曱基端开始编号)之间形成双键的脂肪酸去饱和酶，所述12和13位碳即对应于长18碳的脂肪酰基链的6和7位石友(从羰基碳开始编号)的位置。如本文所述，在本发明上下文中，a-6去饱和酶催化从亚油酸到y-亚麻酸的转化。"分离的核酸片段或序列"为单链或双链rna聚合物，其可任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。dna聚合物形式的分离的核酸片段可由cdna、基因组dna或合成dna的一个或多个区段组成。重组核酸并非天然存在的序列，或具有由人工序列制备的序列的序列，该人工序列通过人工组合两个在其他情况下为分开的序列区段来制备。该人工组合通常通过化学合成来实现，或更通常通过人工操作分离的核酸区段来实现，例如通过基因工程技术，例如阐述于sambrook等molecularcloning:alaboratorymanual,第二版，coldspringharborlaboratorypress,ny,1989中的技术来实现。"基因"指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在前(5，非编码序歹'j)和在后(3，非编码序列)的调节序列。"启动子"指能够控制编码序列或功能rna的表达的dna序列。"编码序列"指编码特定蛋白质的dna序列，其不包括非编码序列。其可组成"非间断编码序列"，即缺乏内含子，或其可包括一个或多个由合适的剪接界限定的内含子。"起始密码子"和"终止密码子，，指编码序列中三个相邻核苦酸的单位，其分别限定蛋白质合成(mrna翻译)的起始和链终止。"可读框，，(orf)指在起始密码子和终止密码子之间不被内含子间断的编码氨基s复序列的编码序列。"操作性连接(operablylinked)"指核酸片段连接以便一个片段的功能由另一个片段来调节。"同系物"指享有共同的祖先序列并当携带该祖先序列的物种分裂为两个物种时趋异的两种核苷s^f列或氨基酸序列。同系物经常表现相当大程度的序列同一性。本文的"转化"指将外源基因转移到宿主生物的基因组中并且其在遗传上稳定遗传。本文所用"表达，，指来源于本发明核酸片段的有义rna(mrna)或反义rna的转录和稳定积聚。表达还指将mrna翻译成多肽。术语"质粒"、"载体"和"盒"指染色体外元件，其通常携带不构成细胞主要新陈代谢部分的基因，所述基因通常呈环状双链dna片段形式。这样的元件可为起源于任何来源的自主复制型序列、基因组整合型序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状单链或双链dna或rna,其中很多核苷酸序列已被连接或重组为能够将启动子片段和所选基因产物的dna序列连同合适的3'非翻译序列导入到细胞中的独特结构。"表达盒"指这样的特定载体，其含有外源基因且除外源基因外还具有允许该基因在外源宿主中表达增强的元件。根据本发明的一个方面，用部分a-4去饱和酶基因筛选了裂殖壶菌(sc1)(下文称为"sci")cdna文库。这导致鉴定了与各种其它生物体的△-6去饱和酶基因同源的长617个碱基对的克隆。该鉴定的克隆为部分cdna克隆。根据本发明另一方面，将该鉴定的部分克隆用于筛选scibac文库。筛选bac文库导致鉴定出包含a-6去饱和酶基因全长序列的阳性克隆。对该克隆进一步进行测序，鉴定出该序列内的a-6去饱和酶orf(可读框)。a-6去饱和酶的核酸序列业已示于seqid1中。该核酸序列翻译为472个氨基酸的蛋白质。来自sc-1的a-6去饱和酶的氨基酸序列业已示于seqid2。本发明包括来自其它生物体例如sc-1的其它"可得到的"a-6去饱和酶。"可得到的"指与本文提供的编码生物活性蛋白质的序列具有充分相似序列的那些去饱和酶。在本发明的再一方面，比较所分离的a-6去饱和酶与不同物种的a-6去饱和酶的同源性程度。分离的a-6去饱和酶的核酸序列与编码来自其它生物体的a-6去饱和酶的dna序列比较为"同源"或"相关"。"同源'，或"相关"包括与例示性的生物体例如琉璃苣、五c/2&m取""a"o/iiay、高山被孢霉和畸雌腐霉cfya/mw/庁egwaare)比较时为相同或保守取代的那些核酸序列。两种核酸或两种氨基酸序列之间的相似性用序列同一性百分比来表示。两个序列之间的序列同一性百分比越高，这两个序列就越相似。对序列进行比对，且在比对中允许引入空位，用计算机算法来定量同一性区域。通常用计算机程序的默认参数来设置允许空位和其它变量。序列比对的方法为本领域所熟知。各种程序和比对算法由pearson等，methodsinmolecularbiology24:307-331，1994和altschul等，naturegenetics.6:119-129,1994阐述。altschul等对序列比对方法和同源性计算提出了详细的考虑。ncbibasic局部序列比对搜索工具(blast)(altschul等，j.mol.biol,215:403-410，1990)可从几个来源4寻至u,包4舌thenationalcenterofbiotechnologicalinformation(ncbi，bethesda,md.)和在互联网上，或与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx等联合使用。另外，本领域普通技术人员应该了解，多肽可具有某些以使多肽功能不改变或受损的方式保守取代的氨基酸。从如图l所示所进行的比较同源性来看，很显然在所比较的生物体中组氨stt序是保守的。在本发明另一方面，对a-6去饱和酶序列进行基序搜索以确证去饱和酶结构域的存在。基序搜索结果示于图no:2中。由此确证该基因具有完整的去饱和酶结构域和功能性去饱和酶特征性的细胞色素b5结构域。含有所有或部分所揭示核酸的重组核酸，例如seqid:1中所述的，例如作为计划表达蛋白质的克隆的部分，操作性连接到另一核酸元件例如启动子。用于这样的目的的克隆和表达系统可市购。本发明也提供含有编码a-6去饱和酶的dna的载体。多种宿主细胞可用于表达蛋白质。例如各种酵母菌抹和酵母来源的载体通常用于表达和纯化蛋白质。本发明用酿酒酵母作为表达所克隆基因的宿主。但也可设想用其它表达系统，例如巴斯德毕赤酵母f/c/z/a/a加n^j表达系统。用于转化合适宿主细胞的载体或dna盒为本领域所熟知。然而，通常可将含有指导相应基因转录和翻译的序列的载体或盒、选择标记表达载体例如pet系统用于表达目标基因。载体可为质粒、粘粒或噬菌体，为本发明目的优选质粒，所述载体可包含在宿主细胞中有功能并能引发由核苷酸序列编码的去饱和酶的表达的核苷酸序列(例如启动子)。(启动子与编码序列"操作性连接")。某些合适的启动子包括编码t7、tpi、乳糖酶、金属硫蛋白的基因或在半乳糖存在下被激活的启动子例如gal1和galio。用于表达的启动子种类应该取决于所需表达产物的种类，还有宿主细胞的性质。例如在本发明中，gal1或gal10启动子用于控制a-6去饱和酶基因序列的表达。可使用多种调节序列中的任一种，其取决于所需要的是组成型转录还是诱导型转录、表达目标orf的启动子的效率、构建的便利性等等。业已发现在酵母细胞中，翻译起始密码子'atg，周围的核苷酸序列影响表达，为了达到所需的表达水平，可修饰外源基因的某些核苷酸序列。为了在酵母中表达，这可通过将低效表达基因符合读框地融合到内源酵母基因(优选高表达的基因)进行定点诱变来实施。在转化后，可用有用的选择标记来选择成功转化的细胞。用于选择的选择标记不限于链霉素(streptomycin)、氨苄青霉素(ampicillin)等。然后通过本领域普通技术人员所知的方法，例如转染、电穿孔或转化，可将构建的载体导入所选择的宿主细胞。这样的导入技术业已充分阐述于molecularcloning:alaboratorymanual.vol1-3sambrook等，coldspringharborlaboratorypress(1989)中。业已吸收表达盒(其已通过任何吸收dna序列的方法操作)的宿主细胞在本文中将^皮称为"转化的"或"重组的"。本发明进一步用以下实施例来阐明。应该理解，这些实施例尽管指出本发明的优选实施方案，但仅以举例方式给出。从上述讨论和这些实施例中，本领域技术人员可明确本发明的基本特点，在不偏离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改，以使其适合多种用法和情形。实施例实施例1:用部分a-4-去饱和酶基因筛选sc1的cdna文库用通过对sc-1cdna文库测序而得到的部分a-4-去饱和酶基因来筛选sc1cdna文库，导致鉴定出多个克隆。发现617bp的这些克隆之一与几种生物体的a6去饱和酶同源。所述序列具有直贯穿到273个碱基的orjf。3，utr为401个碱基。观察到朝着序列的3，末端的聚腺苷酸化信号"aataa"。当在ncbi蛋白质数据库进行同源性搜索时，表明该序列与车前叶蓝蓟(五c/n'wmp/awtag/"a)、刺阿干初于^4ragam-as/^vc^(3)和五c/z/ww^torakv的a-6去々包和酶的同源性。涉及的方案为-(a)cdna文库接种和转移到膜的方案系列稀释将1^1cdna文库克隆混合物和9^1soc放入eppendorf管(稀释系数io-1)，将该管标记为a。从a管取出lpl克隆混合物，和加入的9^1soc—起放于另一新管，标记为b(稀释系数10-2)。从b管取出1^1克隆混合物，和加入的9j^lsoc—起放于另一新管，标记为c。从a、b和c管各取出1微升，加入99^1soc。接种1.将来自各管的loopl最终克隆混合物接种到分开的lbamp平板。2.让平板在37。c培养过夜。3.将具有104细胞/平板或更多细胞的平板取出用于转移。转移到膜上1.为了使克隆正确定位，用墨汁在四个地方标记平板。2.将尼龙膜倒置在平板上，使其浸泡1-2分钟。3.用无菌镊子从一边夹起膜，然后风干，进一步吸收用于杂交。(b)通过随机引发而制备标记探针的方案1.将用于标记的dna;容于无菌水或10mmtrishc1(ph-8.0)、lmmedta到10pg/ml的浓度。2.在95。c让dna变性2分钟(通过让含有dna的小管保持在沸水浴中)，立即在冰上冷却。3.用以下次序将试剂加入到保持在水上的小eppendorff管中，以标记50ng的dna:将5pi变性的dna置于小管中；向其中加入5pl随机引物緩冲液，然后加入5)li1随机引物溶液，再加入12|ildntp混合物、2plklenow酶(lu/(il)、18^1无菌水。4.盖上管盖，通过慢慢拍打底部或通过在离心机中'轻拍旋转(tapspin)，来温和混合。5.将管置于丙烯酸保护屏后面，将3pl(3(^ci)p32标记的核苷酸加入到上述混合物中。6.在37。c恒温将管置于pcr模块(block)中。7.然后让管在pcr仪中的在95。c保持15分钟，立即在冰上冷却。8.用作探测的随机标记片段准备好了。(c)杂交方案1.将25.0ml预杂交緩冲液置于杂交瓶中，将膜浸入其中。2.然后将瓶置于设为65。c的分子杂交仪(hybridizationoven)中2小时。3.弃掉预杂交緩冲液，加入25.0ml新鲜预杂交緩冲液。4.将50|lu随机标记探针加入到置于丙烯酸保护屏后面的瓶中。5.将瓶放回到设为65。c的分子杂交仪上过夜。6.将含有溶液的探针倾入标记的放射性废弃罐中以便处理。7.用2xssc于室温漂洗膜以除去任何未结合的揮:针。8.进一步用2xssc 0.1。/。sds于65。c将膜在分子杂交仪的旋转盘上漂洗15分钟。实施例2:用sc-1的a-6去饱和酶部分cdna克隆来构建和筛选bac文库用部分克隆中的一种筛选sc-1的bac文库，导致鉴定出阳性bac克隆。对bac克隆进行测序，鉴定出所述序列内的a-6去饱和酶orf。bac文库构建的方案用1单位ecori限制酶消化通过脉冲场凝胶电泳纯化的dna，其中最大化地获得75-200kb的片段。将经大小选择的dna连接(_/^卓在葛^產wwd7vv4遂凝齊fw0w/〃/,'a^b&o/afe」以7.^:..#a#.我'##农^)到经消化的bac载体(pindigobac536)，在大肠杆菌电感受态细胞中通过电穿孔转化，接种在合适的培养基上。挑出重组克隆，在96孔板中接种于sob,并将该文库以甘油贮液储存于-70。c。筛选bac文库的方案与实施例1中阐述的一样。该序列显示出与不同物种的a-6去饱和酶序列有高度同源性。当进行基序搜索时，所述a-6去饱和酶序列显示出该基因具有完整的去饱和酶结构域和功能性去饱和酶特有的细胞色素b5结构域。实施例3:基因拷贝数的测定用ecori或psti消化分离自sc-1的lo(ig基因组dna,上样到0.8%琼脂糖凝胶，在30伏电压下电泳过夜，将dna转移到尼龙n 膜(milipore)。将通过随机引发用32pdctp标记的sc-1a-6去饱和酶基因在65。c与所述印迹过夜杂交。然后用中等严格性(2xssc-15分钟，2xssc 0.1%sds_15分钟，0.5xssc 0.1%sds-15分钟，65")洗涤所述印迹，对x光胶片曝光。杂交结果示于图3中，杂交结果清楚表明sc-1中存在单拷贝的△-6去饱和酶。在sc-1基因组中没有出现交叉杂交同源序列。实施例4:载体的构建将a-6去饱和酶基因克隆到pesc-trp的位于bamhi和sail位点之间的mcsii位点，置于gal1启动子之下(pet-sc1-d6)。用于扩增的引物如下。d6pesfcgggatcctatgatctggcgggagg表1:用于扩增来自sc1的a-6去饱和酶并将其克隆到pesc的bamhi和sall位点之间的mcsii的合成引物。引物中的限制位点用红色给出。用于20ul反应物的pcr组分milli-q水补充到iox反应緩冲液dntp混合物(10mm)正向引物(5.0皮摩尔/u1)/反向引物(5.0皮摩尔/ul)/sc-1的基因组dna(1oong)taq聚合酶(3u/ul)20|lil2.010.211.011.011.010.1l(约0.3u)循环条件如下:tableseeoriginaldocumentpage17
用以上引物扩增a-6去饱和酶的orf，用bamhi和sail限制并定向克隆到pesc-trp的相应位点。将构建体命名为pet-sc-1-d6，示于图4中。实施例5:酵母的转化将如图4所示的构建体转化到酿酒酵母yph500菌抹，通过pcr确证转化抹。pcr结果示于图5。用gall引物扩增(所用的试剂盒来自stmtagene，酵母表位标记载体)扩增，显示有a-6-去饱和酶基因。制备酵母感受态细胞的方案所有步骤皆在无菌条件下实施。将单个菌落接种到ypd，在30。c过夜生长。用5%接种物使50ml培养物在30。c生长到o.d达到1.0。将细胞留置水上10分钟，以5000rpm在4。c离心io分钟，弃掉培养基。将沉淀重悬浮于同等体积的水(50ml)，在4。c以5000rpm离心10分钟。用同等体积的1m山梨醇将沉淀洗涤2次，以5000rpm在4°c离心io分钟。最后将沉淀重悬于150jil的1m山梨醇，贮存在4"c。该感受态细胞可贮存1周。通过电穿孔转化酵母将6(vl感受态细胞和约l叫的dna置于小瓶中，混合并置于冰上。将其进一步放在0.2cm电穿孔池上，给予设为sc2(1.7kv和5.8ms)的脉冲。立即加入600|il的1m山梨醇，将细胞重新悬浮，转移到小瓶中，在室温贮存5分钟。将200^1细胞涂布在合适的选择培养基上，在3(tc培养2天。预期的菌落lt目为每200(j涂布培养物含100个。通过在含色氨酸的sd营养缺陷型培养基(sddropoutmedia,sigma)中生长，选择转化的酵母细胞。实施例6:体内功能证明在用含有a-6去饱和酶和芥菜a-12去饱和酶的pesc-trp构建体转化的酵母菌抹yph499中实施体内功能证明实验。在该培养基中未加入前体脂肪酸的情况下，用该构建体可观察到体内a-6去饱和酶活性。在pesc-trp中mcsi的ecori和spel位点之间克隆的a-6去饱和酶用bamhi和sail来限制。用bamhi和sail消化携带a-12去饱和酶的peh-d12-bj-co克隆，分离出由此释放的a-12去饱和酶。将后者定向克隆到上述构建体的相应位点mcsii。由此获得的构建体具有mcsi的a-6和mcsii的a-12。将以上构建体称为pet-d6sc1-d12bj-c0c图6)。通过pcr扩增和序列测定，确证某些所选择的克隆中存在这两种基因(图7)。让重组克隆在不含色氨酸的sd培养基(0.67%酵母n2碱w/o氨基酸；2%葡萄糖；0.13%不含色氨酸的氨基酸营养缺陷型粉)中过夜生长。以5,000rpm离心10分钟将细胞沉淀，用无菌水洗涤一次，重新悬浮于不含色氨酸的sg培养基(0.67。/。酵母n2碱w/0氨基酸；2%半乳糖；0.13。/。不含色氨酸的氨基酸营养缺陷型粉)中。让培养物在30。c培养l天；沉淀细胞，冻干。为测定脂肪酸的分布型，进行脂质抽提，制备脂肪酸曱酯(fame)，用gc-ms分析。典型的重组酵母克隆的脂肪酸分布型如下表所示。表表达a-12和a-6去饱和酶的酵母的脂肪酸分析脂肪酸组成(gc0/。)脂肪酸pesc△-12 a-6去饱和酶14:00,70.316:019.618.316:138.433.616:2-4.418:05.86.418:135.526.418:2-9.718:3*-0.8*y亚麻酸从上表显然看出，经过诱导，表达a-12和a-6去饱和酶的酵母克隆显示出形成了亚油酸和y亚麻酸。从油酸到亚油酸的体内转化由芥菜a-12去饱和酶实施。克隆的sc-1a-6去饱和酶随后催化亚油酸去饱和为y亚麻酸。本实验证明了sc-1a-6去饱和酶在酵母中进行了功能性表达。权利要求1.分离的核酸序列或其片段，其包含编码具有δ-6-去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补，其中所述核酸序列分离自裂殖壶菌(schizochytrium)sc1。2.分离的核酸序列或其片段，其包含与权利要求1的核酸序列具有至少70%、优选80%、最优选90%同一性的核苷酸序列，或与所述核苷s菱序列互补，其中权利要求1的核酸序列包含seqidno:1的核苷酸存列。3.分离的核酉银列或其片段，其包含权利要求1的编码具有a-6-去饱和酶活性的多肽的核苷酸序列，或与所述核香g臾序列互补，其中所述多肽的氨基酸序列与seqidno:2的氨基酸序列具有至少70%、优选80%、最优选90%同一性。4.上述权利要求任一项的分离的核酸序列，其中所述序列编码功能活性的a-6-去饱和酶，所述酶用多不饱和脂肪酸作为底物。5.表达载体，其包含权利要求1-4中任一项的分离的核^列，所述核酸序列操作性连接到能够影响所述分离的核酸表达基因产物的启动子和终止信号。6.权利要求5的表达载体，其中所述启动子为gall启动子。7.表达载体，其如图4所示。8.酵母细胞，其已用权利要求5或6或7的表达载体转化。9.用分离的核酸序列转化的酵母细胞，所述核酸序列编码具有将结合脂质的脂肪酸去饱和活性的蛋白质，其中由所述核酸序列编码的a-6-去饱和酶将多不饱和脂肪酸特异性地转化为co-3脂肪酸。10.生产多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括以下步骤(i)用部分a-4去饱和酶基因进行cdna文库筛选，导致鉴定出部分cdna克隆；(ii)用部分cdna克隆筛选裂殖壶菌sc-1的bac文库，以便鉴定阳性bac克隆；(iii)对所述阳性bac克隆进行鉴定和测序，并进一步鉴定全长序列内的△-6去^^和酶orf;(iv)构建包含操作性连接到调节序列的所述分离的核酸序列的载体；(v)在足以表达所述去饱和酶的条件和时间下，用所述构建体转化宿主细胞，宿主细胞特别是酵母细胞，更特别是。11.包含至少一种多不饱和脂肪酸的组合物，所述多不饱和脂肪酸选自按照权利要求10的方法生产的多不饱和脂肪酸产物。12.权利要求11的组合物，其中所述组合物选自婴儿配方奶粉、膳食补充品和膳食替代品。13.权利要求11的组合物，其中所述组合物给予人或动物。14.权利要求ll的组合物，其中所述组合物经肠道给予或胃肠外给予。15.预防或治疗由多不饱和脂肪酸摄取不足引起的病症的方法，该方法包括将权利要求11的组合物以足以实现所述预防或治疗的量给予所述患者。全文摘要本发明涉及从裂殖壶菌属(schizochytrium)分离的△-6去饱和酶基因。本发明进一步涉及在酵母中克隆来源于裂殖壶菌属的△-6去饱和酶。揭示了△-6去饱和酶的核酸序列和氨基酸序列。进一步揭示了构建体、包含与异源调节序列功能性组合的编码△-6去饱和酶这种酶的基因的载体。所述新型△-6去饱和酶可用于将亚油酸转化为γ亚麻酸的代谢途径(ω-6途径)。本发明提供来自裂殖壶菌属的这些编码上述蛋白质的新型核酸的鉴定、分离。本发明具体列举了带有包含△-6去饱和酶基因的载体的重组酵母细胞，其依靠所产生的酶将能够产生γ-亚麻酸。文档编号c12n15/53gk101268190sq200680034136公开日2008年9月17日申请日期2006年7月20日优先权日2005年7月20日发明者v·m·帕特尔申请人:阿维斯塔金格兰技术有限公司